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流式细胞仪的 FLOW CYTOMETER 流式细胞术 流式细胞术是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。 三、几种常用的流式检测方法 综合三个系统的功能: 液流系统:将细胞依序送到测量区受检。 光学系统:产生并收集荧光、光散射等信号。 电子系统: 将光学信号转换成电子信号。 分析所输出的电流讯号，以脉冲高度、宽度、积分面积显示。 量化讯号并传至电脑。 流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度 4．流式细胞仪的分辨率 5．流式细胞仪的分选速度 基本原理 　　 主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性。 细胞核的特征性改变 细胞核的改变 2. 光散射特性 Annexin V Assay ???淋巴细胞亚群测定 T淋巴细胞?(CD3+) T?辅助细胞?(CD3+CD4+) T?抑制细胞(CD3+CD8+)? B?淋巴细胞（CD19+或CD20+） NK?细胞?(CD3-CD56+)  对于要作胞浆内检测的标本，先固定，然后可长时间的保存。但标本的保存时间要取决于抗原的种类及染色的方法。 虽然标本可以保存一定时间， 但有条件应立即送检。因为死亡细胞会增加结果分析的难度。 新鲜血液和骨髓标本 抗凝新鲜血液和骨髓标本在室温条件下（注意不能低于100C或高于370C），且在储存时限以内，可以不作任何处理直接转运。但转运途中要注意不能剧烈震荡，以免溶血。 标本的转运 对于固定标本 根据不同的实验目的选择不同的固定剂。最常用的是4%的甲醛固定15分钟。适用于各类蛋白质的检测。 70%冰乙醇，用于细胞周期分析的标本固定 60%的酸性丙酮PH4.2，固定10分钟。适用于血及骨髓标本磷酸酶和酯酶的检测。 固定完全的标本，可以转运和存放。 对于需要作膜标记而送检又较远的标本 作膜标记一般需要保持细胞的活力，故需要 Ficoll分离单个核细胞。然后加入1640完培， 并含DMSO，置液氮或 -700C转运。 标本的制备 免疫标记（膜表面)的样本处理 保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。 300目尼龙网过滤 调整细胞浓度：2~5X106/ml， 标记：取100ul样本 + 适量抗体 孵育：室温避光20分（或根据抗体说明） （加二抗） 溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨） 检测： 免疫标记（细胞浆内)的样本处理 先将细胞膜“打孔” ----破膜 破膜剂的选择：Triton 皂素 毛地黄毒甙 按前述方法进行标记 细胞周期分析的样本处理 传统方法： 单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞） 冰乙醇固定过夜 洗涤细胞 加复合染液（Triton，RNA酶、PI） 20--30分钟后上机检测 BC公司DNA-Prep试剂 溶血（如需要） 固定染色一步完成 20分钟后上机检测 FCM是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时相应的对照管是必不可少的。 细胞免疫功能受多种生理病理因素影响很大，下结论时应结合临床 选择抗体时要遵循以下原则：选择亲和力高的抗体；由于不同的单克隆抗体针对的抗原表位不同，应该选用合适克隆的抗体；由于抗原分子的表达程度不同，应选用合适的荧光标记，尤其是对于表达弱的抗原，应用强的荧光素标记；注意抗原表达在不同品系的差异，尤其是针对动物抗原。 二、流式细胞仪的应用 细胞生物学 临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 (一) FCM在细胞生物学中的应用 检测细胞的结构组成：大小、粒度、DNA含量、RNA 含量、蛋白质含量等。 检测细胞功能：细胞表面及胞内抗原、细胞因子等。 细胞DNA分析原理 利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞