Genome Editing 基因组编辑.PDFVIP

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2017, 57(11): 1634-1642 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Genome Editing 基因组编辑 CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术在丝状真菌中的研究 进展 * * 刘星晨，谷守芹 ，董金皋 河北农业大学生命科学学院，真菌毒素与植物分子病理学实验室，河北 保定 071001 摘要：CRISPR/Cas9 技术是在特定的RNA 引导下，利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。 自2013 年该技术体系建立起来已成功应用于动物、植物及真菌中。本文简述了3 种基于核酸酶的基因 编辑技术及其应用，概述了CRISPR/Cas9 系统的组成及其作用机理，总结了CRISPR/Cas9 在模式真菌 酿酒酵母及丝状真菌中的应用，并就在丝状真菌中应用该技术时sgRNA 表达盒的设计、Cas9 表达盒的 优化、抗性标记的筛选、受体的选择等方面提出具体的研究方法。另外，针对该技术应用过程中出现的 脱靶效应、Cas9 核定位信号的添加、启动子的选择及多个靶基因的编辑等问题提出了建议与展望，希 望能够为初次涉足该领域的科研人员提供理论参考和技术支持。 关键词：基因组编辑，人工核酸酶，CRISPR/Cas9 ，植物病原真菌 基因组定向编辑技术是指对基因组中的不同 辑效率大为提高，其中 CRISPR/Cas9 技术目前已 功能区段进行编辑，或通过剪除DNA 片段来敲除 经成为基因功能研究中首选的“标准技术” ，该技 某基因的功能，或通过向基因组中插入新的片段 术在未来一段时间里将继续推进功能基因组的研 引入新的功能，可实现对染色体特定部位的基因 究，不仅可使遗传工程进入崭新的阶段，也将使 进行改造，是研究基因功能的重要手段之一。早 生命科学各个领域发生日新月异的巨变。本文简 期的基因编辑技术主要是利用基于同源重组原理 述了 3 种基于核酸内切酶的基因编辑技术及其应 进行基因打靶，但由于基因重组效率极低，大大 用，概述了CRISPR/Cas9 系统的组成及作用机理， 限制了基因功能的研究进展。近年来，科研人员 详细阐述了该技术在模式生物酿酒酵母及植物病 研发出基于特殊核酸酶的基因编辑技术使基因编 原真菌中的应用现状，并根据本课题组的研究经 基金项目：国家自然科学基金 ；河北省自然科学基金(C2014105067 ，C2017204069 ，C2017204076) ；河北 省研究生创新项目(1099009) *通信作者。谷守芹，Tel/Fax ：+86-312-7528876 ，E-mail ：gushouqin@126.com ；董金皋，Tel/Fax ：+86-312-7528266 ，E-mail ： dongjingao@126.com 收稿日期：2017-02-28 ；修回日期：2017-05-23 ；网络出版日期：2017-07-10 刘星晨等 | 微生物学报, 2017, 57(11) 1635 验提出了该技术在丝状真菌中应用的优势及技术 2 CRISPR/Cas9 系统的组成及作用 要点，以期为初涉本研究领域的学者提供理论和 机理 技术参考。 2.1 CRISPR/Cas9 系统的组成 1 基于核酸内切酶的基因编辑技术 CRISPR 是规律成簇的间隔短回文重复 最早应用的核酸内切酶包括锌指核酸酶 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 的简称，该类序列广泛存在于40% 的细菌 (zinc-finger nucleases ，ZFNs)和类转录激活因子效 和