2011～2012年嘉兴市乙型流感病毒监测和HA1基因特性研究.docVIP

2011～2012年嘉兴市乙型流感病毒监测和HA1基因特性研究 　　[摘要]目的：了解2011～2012年嘉兴市乙型流感病毒的流行及HA1基因特性、变异特点及WHO推荐流感疫苗株对人体的保护情况。方法：将采集的流感样病例的咽拭子标本用MDCK细胞培养分离流感病毒，用标准血清及荧光定量RT-PCR方法鉴定。随机选取6株乙型流感进行HA1基因核苷酸序列测定，并进行特性分析。结果：2011～2012年嘉兴乙型流感Victoria系和Yamagata系同时存在。随机抽取4株Victoria系和2株Yamagata系毒株，在糖基化位点上没有变化。4株Victoria系毒株核苷酸同源性为98.6～99.7%，氨基酸同源性为98.8～100.0%，其中2株与2009～2012年疫苗株相比，在L58P、N129S、I146V、N171D发生了氨基酸的替换；2株Yamagata系毒株核苷酸和氨基酸同源性为99.4%，与2012～2013年疫苗株极为接近。结论：嘉兴市流行的Victoria系乙型流感病毒与2009～2012年疫苗代表株同源性较高，当年度的流感疫苗株对本市Victoria系乙型流感病毒流行的防治有一定保护作用。但本地同时也还活跃着Yamagata系的乙型流感病毒，当年度的流感疫苗株对Yamagata系乙型流感病毒不能提供最佳保护。 [关键词] 乙型流感病毒；血凝素基因；核苷酸序列；Yamagata系；Victoria系 流感病毒属于正粘病毒科，其基因组为分节段负链RNA，分为甲、乙、丙3种型别，均可感染人。甲型流感病毒由于其传播速度快，感染性强，且抗原容易变异，所以容易造成局部爆发，甚至是世界大流行。乙型流感病毒常常引起局部流感爆发。流感病毒血凝素抗原（HA1）是其主要抗原之一，是流感病毒发生抗原性变异的分子基础。根据嘉兴市近几年的流感监测情况发现，乙型流感病毒也是相当活跃的，所以非常有必要了解嘉兴市乙型流感病毒基因的变异情况和WHO推荐流感疫苗株对人体的保护情况。因此，我们对采集的流感样病例的样本进行流感病毒的核酸监测，并进行病毒分离和鉴定，随机抽取了2011～2012年共6株分离到的乙型流感病毒，对毒株的血凝素HA1基因进行了序列测定及分析。 1 材料与方法 标本来源 采自本地区的国家级流感哨点监测医院（嘉兴市第一医院），按照流感样病例的定义，采集发病3天内且未服用过抗病毒药物的流感样病例的鼻咽拭子和含漱液标本，24 h 内专人运送至本中心流感网络实验室。 1.2 荧光定量RT-PCR试剂和仪器 标本进行荧光定量RT-PCR检测，荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI7500。病毒核酸提取试剂为AMBION INC （THE RNA COMPANY）试剂盒，引物探针由浙江省疾病预防控制中心提供，Real-time PCR试剂盒：TaKaRa试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司生产。 1.3 细胞培养与试剂 狗肾传代细胞（MDCK）由浙江省疾病预防控制中心提供，本实验室传至适宜代数用于病毒分离。DMEM、胎牛血清等组织细胞培养试剂均为GIBCO公司产品。 1.4 病毒分离及鉴定 参照《全国流感监测方案（2010版）》、WS285-2008《流行性感冒诊断标准》等要求进行病毒分离。观察细胞病变（CPE）并测定血凝素（HA），阳性分离物即为流感病毒分离株，保存于-70℃低温冰箱并用流感标准抗血清进行血凝抑制试验（HI），鉴定型别。流感标准抗原与抗血清由中国疾病预防控制中心国家流感中心提供。 1.5 病毒核糖核酸的提取 随机抽取2011～2012年本实验室从流感样病例标本中分离到并经标准抗血清鉴定为乙型流感病毒的流行代表株共6株，采用德国Qiagen公司的Rneasy MiniKit试剂盒提取毒株RNA。 1.6 RT-PCR反应和HA1基因序列测定 1.7 序列测定和数据分析 2011～2012年共分离到血凝效价1：8的乙型流感毒株共12株。在分离到乙型流感病毒的月份中，2011年1～4月初分离到的乙型流感均为Yamagata 系，共3株。2011年4月中旬～5月和2012年1～4月分离到的乙型流感均为Victoria系，共9株。均采用HI试验鉴定亚型。 2.4 HA1基因进化分析 2.5 HA1基因的同源性分析 2.6 HA1基因的序列分析 讨论 乙型流感病毒的感染过程是由病毒表面HA蛋白结合到宿主细胞表面的唾液酸受体，从而引起人类呼吸系统疾病，根据HA基因核苷酸序列的差异，乙型流感病毒被分为两个系，Victoria系和Yamagata系，两个系之间的抗原不存在交叉免疫反应[1]。分析嘉兴市6株乙型流感的HA