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大蒜拮抗性内生细菌筛选 　　摘 要：本实验以市面销售大蒜作为实验材料，通过表面消毒，利用粉碎机粉碎方法得到植物组织原液的方法，由平板涂布法分离得到药用植物组织内的内生细菌或者直接在无菌环境中取大蒜组织块在PDA培养基或NA培养基直接进行培养，通过不断地分离纯化提取得到的较纯植物内生细菌作为目标菌，以大肠杆菌（Escherichia coli），耐甲氧西林金色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aurous，MRSA），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtitles）作为指示菌进行内生菌抑菌试验，由内生细菌对不同病原菌的抑菌圈大小的比较筛选出抑菌最强的内生细菌。研究结果表明：大蒜中有大量的内生细菌，分离得到16株内生细菌，16株菌对4种以上病原菌均有不同程度的抑制作用。其中DS1、DS2和BS2对四种病原菌的拮抗能力均较强，BS2对四种靶标菌的相对抑菌率在200%以上。 关键词：大蒜 内生细菌 拮抗作用 筛选 中图分类号：S633.4 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）05（b）-0217-02 大蒜（Alliums ativum L.）属于百合科（Liliaceace）葱属类的植物，据研究大蒜的鳞茎含有丰富的生物活性成分以及营养物质，同时也具有良好的抗癌防癌作用，不但对癌细胞有直接杀伤作用，而且能抑制致癌物质（如亚硝胺）在人体内的合成，并能防治脑血管病、糖尿病等常见病状[1]，经常使用大蒜也能增加能量转换和促进血液循环，提高我们肌体免疫力，恢复和重建爱滋病患者的免疫系统功能等[2]。此外，大蒜里的某些成份，有类似维生素E与维生素C的抗氧化、防衰老特性，自古被称为天然杀菌剂，有“天然抗生素”之称[3]。大蒜除了有以上作用外，其生物体内所含的硫化合物也具有较强的抗菌消炎作用，对多种细菌、真菌都有杀死和抑制的作用[4]。当前，关于药用植物大蒜内生细菌的研究报道少见。面对着各种各样新的疾病对人们健康的威胁，抗生素的广泛运用使致病菌的赖药性变得越来越强，迫使人们不得不寻找新的治病材料和途径。与此同时人们的生活水平的提高，对健康越来越注重，提倡绿色无公害食品，需要采用一种新的方法取代化学防腐剂。因此，当前人们正致力于从动植物及微生物的代谢产物中寻找抗菌物质以取代化学防腐剂，利用药用植物内生细菌进行工业化发酵生产某些重要天然药物。植物内生细菌一直以来备受关注，因为其具有的作为新型药物筛选资源的巨大潜力[5]。不仅如此，植物内生细菌的发展也能有效地缓解一些天然药用植物的资源缺失，甚至对生态平衡破坏，物种灭绝也将起到有效缓解作用，同时也为植物资源的合理有效利用提供了理论基础[6]。本实验对药用植物大蒜内生细菌进行分离纯化以及拮抗菌筛选试验，进一步明确药用植物大蒜内生细菌及其抗菌作用，为大蒜内生菌的进一步发展及开发利用以及探寻有效拮抗微生物资源提供基础保障。 1 材料与方法 1.1 实验植物 市售紫皮独蒜（Alliums ativum L.（Garlic））、白皮鲜蒜（Alliums ativum L.（Garlic））。 1.2 靶标菌 大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtitles）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococcus aurous，MRSA），均由由本校病理实验室提供。 1.3 培养基 大蒜组织的表面消毒及组织液制备：称取10 g供试大蒜组织样品，放于灭菌的培养皿或者三角瓶中，无菌水洗3至5遍，再用百分之五的次氯酸钠消毒3次，2 min每次，后用无菌水再洗3至5遍，用打浆机打碎，最后将粉碎的供试植物组织液置于无菌三角瓶中备用[9]。 大蒜内生细菌的分离纯化：在无菌操作台上分别用无菌移液枪将得到的大蒜组织液取100 ul种到无菌PDA平板培养基上，取最后一次洗涤液作为对照，每种处理重复三次。37 ℃培养18～24 h。待培养基上长出菌落时，根据菌落的颜色和形态，将不同种类的内生细菌划线接种至PDA无菌平板培养基上培养，得到无纯培养后接种到斜面保存备用[10～11]。 1.5 大蒜内生细菌的拮抗性筛选 2 结果与分析 2.1 大蒜内生细菌的分离 2.2 拮抗菌株的筛选结果分析 3 结论与讨论 （1）通过对大蒜内生细菌的分离纯化及其对一些常见病原菌的拮抗性作用，表明在大蒜内生细菌中广泛存在具有较高抗菌活性的菌株。拮抗实验表明大蒜鳞茎内生菌主