生物负载测定.ppt

微生物采集技术和设备 平板倾注 使用平板倾注技术，将一定量的悬浮液在在约45℃的温度与融化的琼脂相混合，然后倾注到平板放至凝固。对平板进行培养至菌落形成并进行计数。 平板涂抹 平板涂抹技术是用涂抹器将一定量悬液涂在固体营养基表面。 螺旋涂板 螺旋涂板技术运用自动装置将一定量微生物悬液涂在固体培养基表面上。悬液涂抹是以递减的速度从培养板中心以螺旋线轨迹向周边运动。经过培养后，对全板或部分板，运用专用的计数栅和计数技术来统计原始悬液中的存活微生物数量。 * 微生物采集技术和设备 检测微生物的其它方法 估计生物负载时还可使用菌落计算以外的其他方法。这包括测定新陈代谢物的活性（例如：新陈代谢物测定或落射表面荧光）。这些方法称为“间接法”，为了建立起与以往确定的存活微生物数量的关系，它们必须对照菌落计数进行校准。这些技术的一个主要限制就是需要相对较高的微生物数悬浮在样品洗脱液中。一般来说，所检测到的微生物数量的下限超过100 CFU。 * 微生物鉴定（一） 微生物鉴定的方式和意义 方式 形态鉴定、培养及生理特征、生化特征、 核酸特征鉴定 数值鉴定和自动鉴定 意义 从鉴别污染微生物可了解洁净室清洁，消毒步骤的效性，特别是对消毒剂有效性评估有所帮助。微生物鉴别的结果也对调查污染的来源有参考价值。 * 常用的微生物操作技术 接种：将含有或可能含有微生物的样品或培养物，种入培养基的技术方法。 斜面培养基接种法、半固体培养基接种法、液体培养基接种法、平板培养基接种法。 分离：使用一定的分离技术，将混杂存在的微生物尽可能在培养基中分开并且生长，从而获得单一的一种菌株的方法。 划线分离法、涂布分离法、倾注分离法 培养：通常接种后的培养基都要在适宜的环境中条件下进行培养。主要是温度、湿度、培养时间 ，特别是氧气和二氧化碳的需求。 需氧培养法、厌氧培养法、微需氧培养法、二氧化碳培养法 * 常用的微生物操作技术 染色： 原因：微生物细胞含水量一般为80%~90%，菌细胞对光的吸收和反射与水溶液相近，在光学显微镜下，菌体透明，与背景几乎无差别，故常借助染色使菌体吸着染料产生与背景较明显的差别。 常用细菌染色法 单染色法：仅使用一种染料，只能观察形态和排列 复染色法：革兰染色法，可将全部细菌分成2类，革兰阳性菌、革兰阴性菌。 芽孢染色法：很有用的一种染色法，因为芽孢对灭菌的压力比较大，存在灭菌失败的风险—特别是根据生物负载设定么军参数的方法。 鞭毛染色法 * 微生物鉴定（二） 核酸特征鉴定之一 16SrRNA序列分析 基本步骤： * DNA提取 PCR扩增 凝胶成像检测 琼脂糖凝胶电泳 回收 序列分析 数据库比对 微生物鉴定（三） 16SrRNA序列分析的注意事项 引物的选择 PCR条件的设定 * 生物负载测定 * 微生物的定义和分类 原核类：细菌、放线菌、支原体、蓝细胞 立克次氏体、衣原体 微生物 真核类：真菌(酵母菌、霉菌）、原生动物、 显微藻类 非细胞类：病毒、类病毒、朊病毒 * 定义： 一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。 细菌细胞形态显微镜检照片 放大1000倍杆菌 放大1000倍球菌 * 微生物细胞结构示意图 细菌细胞结构图 真菌细胞结构图 * 微生物的五大共性 1、体积小，面积大 巨大的营养吸收面、代谢废物的排泄面和环境信息的接受面 2、吸收多，转化快 高速生长的物质基础，活的化工厂。 3、生产旺，繁殖快 大肠埃希菌20min分裂1次，48小时后的重量则达到地球的4000倍。 注：因营养条件的限制，实际不可能发生。 4、适应强，易变异 极端环境的惊人适应能力 5、分布广，种类多 空气、水体、土壤、动植物都有分布，微生物有10多万种。 * 微生物的存在对医疗器械的影响 活的微生物对灭菌影响 非过度灭菌的工艺因医疗器械上生物负载增加，灭菌难度加大，可能导致灭菌失败。 活的微生物对使用者危害 灭菌不彻底的无菌医疗医疗器械，根据使用方式的不同，可能出现炎症、菌血症等病理反应。 微生物尸体对使用者的危害 典型例子：G-菌细胞壁脂多糖成分(内毒素)通过输液进入人体血液，致使人体发热。 * 基本概念 生物负载的定义 一件产品和/或无菌屏障上或其中存活的微生物总数。 ※对灭菌来说：生物负载应为无菌屏障内的所有微生物。因为，灭菌需要杀灭屏障内的所有微生物。 ※对使用来