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荧光定量PCR法检测线粒体基因A1555G和C1494T突变 　　[摘要] 目的 对非综合征型耳聋患者及其家属进行线粒体基因A1555G与C1494T突变分析，以明确聋病先证者分子病因。 方法 收集非综合征耳聋患者及其家属共95 例受检者的外周血样本，常规方法提取基因组DNA，进行荧光定量PCR检测。同时对所提取的基因组DNA采用传统的毛细管电泳测序分析，并与NCBI GenBank 数据库人线粒体基因序列进行比对，从而确诊是否为线粒体基因突变。 结果 两种检测方法均表明，非综合征耳聋患者及其家属中共检出线粒体基因A1555G突变4例，占聋病先证者7.41%（4/54），未检测到线粒体基因C1494T突变，4例阳性患者双耳均有不同程度的损伤，且均为女性。 结论 采用荧光定量PCR法检测线粒体基因A1555G与C1494T突变，方便、快捷、准确，能辅助临床快速的分析诊断药源性耳聋的分子病因。 [关键词] 荧光定量PCR；线粒体基因；A1555G；C1494T；药源性耳聋 [中图分类号] R764.44 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）10（a）-0159-03 线粒体12SrRNA基因是氨基糖苷类抗生素导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。由于A1555G和C1494T突变在12SrRNA基因形成G-C和U-A配对使得与氨基糖苷类抗生素的结合更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会出现或加重耳聋的原因[1]。因此，对这两个点突变的检测，对于预防氨基糖苷类抗生素中毒性耳聋有着重要的临床意义。目前关于线粒体耳聋基因的检测方法有多种，文献已报道的方法有酶切法[2-3]、直接测序法[2-6]、基因芯片法[7-10]、实时荧光定量Taqman探针法[11]等。检测的突变热点主要是1555、1494、961等[12-13]。本次试验采用荧光定量PCR法检测95例非综合征药源性耳聋患者及其家属线粒体基因A1555G、C1494T突变，并采用传统的毛细管电泳测序法进行确证，现将检测结果报道如下： 1 资料与方法 1.1 一般资料 95例非综合征型耳聋患者及其家属均为汉族，其中，男44例 女51例，聋病先证者54例（男39例，女15例）。经知情同意后，首先对先证者及其家属进行病史调查，包括家族史、耳聋史及耳毒性药物的使用情况等，同时进行纯音听域测试，明确先证者均为非综合征型耳聋。 1.2 仪器与试剂 PCR 扩增仪（Bio-Rad 公司）；ABI 3130 测序仪、ABI 7500荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）。Taq酶、dNTP（北京百泰克生物技术有限公司）；测序引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；药物性耳聋基因突变检测试剂盒及阳性对照试剂（智海生物工程北京有限公司）。 1.3 全血基因组DNA提取 用枸橼酸钠抗凝的一次性采血管，取受检者的外周静脉血约2 mL，采用离心吸附柱法按照血液基因组DNA提取试剂盒的操作说明书操作，提取受检者全血基因组DNA，用琼脂糖凝胶（1%）电泳检测。所提取的DNA条带清晰，完整性好，紫外分光光度计检测DNA浓度约为50 ng/μL。 1.4 荧光定量PCR检测 取出试剂盒中扩增反应液，解冻后取18 μL，再加入2 μL提取得到的DNA或对照品溶液，混匀，然后上机进行检测。温度循环程序分4个步骤：①37℃ 5 min，1个循环；②95℃ 15 min，1个循环；③95℃ 15 s，54℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环；④95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15s，60℃ 15 s，1个循环，进行熔解曲线分析。 1.5 mtDNA测序 1.5.1 PCR反应 PCR引物根据从NCBI下载的人线粒体基因组序列，利用Gene Tools软件自行设计，所设计引物的PCR产物为线粒体1262～1772位点，共计511 bp，能同时检测1494与1555位点的突变。PCR反应体系见表1。PCR程序：①94℃ 5 min，1个循环；②94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环；③72℃ 10 min，1个循环。 1.5.2 测序 将PCR产物经常规方法制备成测序模板后用传统的双脱氧链终止法在ABI 3130测序仪上测序分析。 2 结果 2.1 荧光定量PCR检测结果 除空白对照组外，各反应管均出现特异性扩增，各PCR产物的Tm值之间均能很好的进行区分（大于2℃），1494T标准对照管出现78.2℃和84.5℃的熔解峰，分别为1494T和质控峰（图1A）；1555G标准对照管主要出现74.