两种镰刀菌葡萄糖淀粉酶部分酶学性质探究.docVIP

两种镰刀菌葡萄糖淀粉酶部分酶学性质探究 　　摘要：对串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）和禾谷镰刀菌（F. graminearum）所产葡萄糖淀粉酶部分酶学性质进行了研究，结果表明这2种镰刀菌产的葡萄糖淀粉酶的性质较为相似。50～60 ℃酶活性较高，最高酶活性出现在50 ℃，串珠镰刀菌比禾谷镰刀菌所产生的酶热稳定性稍高。pH 5.0～6.0之间酶活性较高，pH 5.0～8.0之间稳定。金属离子Mn2+、Cu2+对2种镰刀菌产酶的酶活性有较强的激活作用，其中Mn2+激活作用最强烈，Mn2+作用后禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分别为对照的176%和173%。金属离子Na+、Ca2+及Fe2+则会抑制这2种镰刀菌产葡萄糖淀粉酶的活性。 关键词：串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）；禾谷镰刀菌（F. graminearum）；葡萄糖淀粉酶；酶学性质 中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6026-04 葡萄糖淀粉酶（E.C 3.2.1.3）从淀粉的非还原端水解α-1，4糖苷键产生β-D-葡萄糖，由于葡萄糖淀粉酶对淀粉的水解以葡萄糖为惟一产物[1]，因此葡萄糖淀粉酶在以葡萄糖为原料的一些生物行业有广泛应用，特别是在食品、医药、发酵等领域[2，3]。 工业上应用的葡萄糖淀粉酶主要来自于曲霉属（Aspergillus）及根霉属（Rhizopus）[4-10]， 镰刀菌属（Fusarium）的葡萄糖淀粉酶报道较少。曲霉属及根霉属菌株葡萄糖淀粉酶及其酶学性质的研究较多[6-10]，镰刀菌属的葡萄糖淀粉酶，如半裸镰刀菌（F. pallidoroseum）[11]、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）[11]、茄腐皮镰刀菌（F. solani）[12]、蔗草镰刀菌（F. scirpi）[12]等也有报道，不同来源的酶性质存在很大差异。这些丝状真菌能够将合成的酶蛋白分泌到胞外，便于酶的提取纯化。不同来源的葡萄糖淀粉酶性质不同，在耐热性、pH稳定性以及催化活性上都存在差别，而不同的生物加工过程需要不同性质的酶，因此对新型的葡萄糖淀粉酶进行筛选并开展性质研究显得特别重要。 前期对几十株真菌进行了淀粉降解酶的筛选工作，从中得到产酶活性较高的一株串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）以及一株禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），本研究对其中的部分酶学性质进行了研究。 1 材料与方法 1.1 材料 串珠镰刀菌以及禾谷镰刀菌由山东省应用微生物重点实验室筛选并保存。生化试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 固态发酵 250 mL三角瓶中装麦麸5 g，加水5 mL，121 ℃蒸汽灭菌。用7 mm打孔器从长满菌丝的PDA平板上打出3个菌斑接种至三角瓶，28 ℃静置培养。分别于72 h以及96 h摇动一次，120 h时测定酶活性。发酵结束后固体产酶培养基中加灭菌蒸馏水100 mL，捣碎，28 ℃摇床振荡浸提1 h，4 ℃、6 000 r/min 离心10 min，上清液为粗酶液。 1.2.2 硫酸铵沉淀蛋白 向葡萄糖淀粉酶粗酶液中加入硫酸铵，不断地缓慢搅拌，直至硫酸铵浓度达到80 %饱和度，置于4 ℃冰箱过夜；10 000 r/min离心15 min，弃上清，将沉淀蛋白用蒸馏水溶解，透析后用于测定粗酶的酶学性质。 1.2.3 酶活测定[13] 底物为用0.1 mol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液体配制的1%可溶性淀粉溶液。25 mL刻度试管中加底物0.9 mL，在测定温度下预热10 min，加0.1 mL适当稀释的粗酶液准确反应5 min，加2 mL DNS溶液，煮沸5 min，流水冷却，稀释至25 mL，540 nm测定吸光值。1 h 释放1 mg 还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个酶活力单位（U）。 1.2.4 最适反应温度和热稳定性[14] 于不同温度下测定酶活，最高酶活定为100%，其余酶活与之相比计算相对酶活，寻找酶的最适反应温度。取适量酶液不同温度下保温，保温结束立即置于冰水中冷却，测定残余酶活，研究酶的热稳定性，以不经热处理的酶活为100%。 1.2.5 最适反应pH和pH稳定性 分别用不同pH的磷酸缓冲液配制可溶性淀粉溶液，测定酶活，最高酶活定为100%，其余酶活与之相比计算相对酶活，寻找最适反应pH。取适量酶液分别在不同pH缓冲液中30 ℃保温6 h，测定残余酶活，研究酶的pH稳定性；以未处理的酶活力为100%，计算相对酶活。 1.2.6 金属离子对酶活力的影响[14] 在反应体系中分别加入（盐酸盐或硫酸盐）Cu2+、K+、