应用基因芯片技术研究心血管活性药物导致心肌损伤的机理-麻醉学专业毕业论文.pdfVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文    正 文 1. 细胞培养: 本组实验采用H9C2心肌细胞系，它来源于BD1X大鼠心脏组织的克隆细胞系， 常被用于研究心肌细胞的功能。这个细胞系中的成肌细胞能融合形成多核的肌 管，并对乙酰胆碱的刺激有反应。50000/ml的细胞种植在12.5cm的无菌培养皿中， 使用DMEM（Invitrogen）培养液加10%胎牛血清和盘尼西林和链霉素。细胞培育 箱条件保持在37℃、5%CO2。细胞培养液培养24小时后细胞贴壁，浓度约为70%-80% 后将细胞随机分成四组——肾上腺素组、米力农组、地高辛组和对照组，分别用 1µM肾上腺素、10µM米力农、1µM地高辛和10ul细胞培养液培养基处理细胞。在处 理1小时、24小时和48小时后收获细胞。使用RNA试剂盒提取细胞RNA（Qiagen）, 然后将RNA浓度调整至约40ng/µL后将RNA逆转录为cDNA，最后扩增出cRNA。再使 用RNA微阵列（Microarray）实验方法，分析不同试剂处理后心肌细胞基因表达 谱的变化，及其与时间的关系。 2. DNA微阵列: 又叫基因芯片（Gene chip），是一块特殊的玻璃片或硅芯片，在芯片数平 方厘米的面积上设置了数千或数万个核酸探针。利用分子杂交的原理，使检体中 用荧光素标记的DNA、cDNA、或RNA等与固定在玻片上的探针杂交后，通过检测杂 交信号强度及后续数据处理，然后把信号转化成不同标本中特异基因的峰度,从 而全面的比较不同标本的基因表达水平的差异。我们采用4x44K的大鼠全基因组 寡核苷酸陈列（Whole Rat Genome Oligo Microarray in 4x44K Format）,可以 一次性检测41534个大鼠基因的表达。此芯片70%以上的探针的特异性和敏感性被 安捷伦公司(Agilent)实验认证流程确认。 3. 基因表达分析: 从实验组和对照组提取的RNA通过特殊的人工逆转录及标记法，扩增出分别 带有绿色（cyanine3)或红色（cyanine5)标记的cRNA（Low RNA Input Linear Amplification Kit, Agilent Technollgies)。对照组cRNA则作为每个实验组的 内对照，并求取相对比值(即基因改变倍数）。每一个实验组和对照组都会做红 绿荧光染料对换标记，即每组样本至少被标记为一次红色和标记为一次绿色，以 消除颜色对实验数据的影响。标记好的cRNA被加载到载有大鼠全基因组寡核苷酸 基因芯片的玻片上进行杂交（Agilent Gene Expression Hybridization Kit)。 玻片安装在安捷伦的SureHyb杂交器上，经过17个小时、65℃、4 rpm旋转混合杂 交后, 用安捷伦基因表达清洗液对杂交完成后的玻片进行清洗，清除残留在玻片 上未杂交的cRNA。最后用安捷伦基因芯片扫描仪读数，获取荧光图像。这些图像 资料通过特殊的软件（Feature Extraction, Agilent Technology）处理转换成 4  华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文    文件资料后，即可用不同的分析软件进行试验数据分析。 4. 实验设计: 本实验一共进行20对cRNA微矩阵分析，配对室验设计如表1所示。每个实验 组都重复出现至少三次（见表2），而且均被标记为红色或绿色作为染料互换， 以消除染料导致的数据差异。 表-1：配对实验分组 实验 Cyanine5 红色 Cyanine3绿色 组 1 肾上腺素 1小时 对照组 1小时 2 对照组 1小时 米力农 1小时 3 地高辛 1小时 对照组 1小时 4 对照组 24小时 肾上腺素 24小时 5 米力农 24小时 对