文库的建立与筛选.pptVIP

cDNA文库构建要点（三） 三、反转录后至包装到噬菌体外壳蛋白之前的诸多步骤的操作相对容易，但其中的层析柱cDNA分级很关键。这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。 cDNA文库构建要点（四） 四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。 cDNA文库构建试剂盒推荐 Stratagene、Novagen、Clonetech、Invitrogen等公司生产的cDNA文库构建试剂盒都非常好用。 有了这些商品化的试剂盒后，cDNA文库能否构建成功几乎就完全依赖于能否获得高质量的mRNA了。 几种cDNA文库构建试剂盒优缺点比较 Stratagene:优点：1. 放射性同位素可跟踪实验进程。 2. 有包装蛋白。缺点：1. 放射性的东西对人体有一定危害。2 载体连接时要加接头,还要磷酸化。 几种cDNA文库构建试剂盒优缺点比较 Invitrogen:采用的是Gateway技术：利用λ噬菌体位点特异重组系统的BP和LR双向反应，首先将PCR产物用传统方法连接到Gateway化的入门载体，这个目标基因就可以迅速方便而且定向地重组到任何Gateway化的表达载体上。优点:1.无需限制酶切、无需连接，只要利用重组酶就可以穿梭于任何 Gateway化的表达载体间，典型的效率高达95％以上，保证正确的方向和阅读框。2.特别适合研究一个基因在不同表达系统中的表达,对于后续的工作有利。缺点:1.无论是Gateway还是Topo，封闭的系统仅适用于Invitrogen提供的表达载体，使得使用成本高。而且在启动子和目的基因间必需插入一段特定的噬菌体重组酶识别序列，对表达的影响不好估计。2.所得的并非都是全长cDNA。 几种cDNA文库构建试剂盒优缺点比较 Clontech:采用的是SMART与Infusion技术：合成引物时两端对应加入任意一种线性化载体两端15个碱基，PCR扩增目标基因后就可以利用重组酶直接将目标基因定向重组到任意指定表达载体上的指定位点。 优点：1.采用SMART技术,可以方便的得到全长cDNA。2.开放的技术平台，任何质粒、任何目的基因都能适用。3.使得PCR产物彻底摆脱了中间载体、重复亚重复筛选的烦恼，一步到位，不受载体和酶切位点的限制，不用连接、补平、磷酸化，也不受PCR产物末端影响，而且速度快（30min），重组效率高达90%。4.在载体启动子和目的基因之间不会增加额外的碱基，真正精确定向克隆。5.Infusion以冻干形式提供，可以在室温下保存和运输，不必担心运输过程中的温度问题。 缺点：1.不适用于一对多的克隆，目的基因无法在不同载体间穿梭。针对每个载体均要合成特定的引物进行PCR。 2.第二链的合成有PCR技术,可能会引起碱基突变。 几种cDNA文库构建试剂盒优缺点比较 Novagen：优点：1.提供两种primer，oligo dT random primer，可根据目的进行选择；2.提供EcoRⅠ/HindⅢ酶切位点，便于定向克隆；缺点:不知什么原因第二链合成效率不高。 基因组文库的保存 λ噬菌体文库的保存比较简单，经过测试连接反应和包装反应条件，选择合适的条件进行大量连接及包装，离心除去沉淀，上清中加入少量（几滴）氯仿，4℃可长期保存。 如果是质粒文库，可将平板上的各个单菌落接种到编号的、含有培养基及筛选因子（如抗生素）的微孔板上，过夜培养，待单菌落长好后，往各孔中分别加入适量的无菌甘油（最终甘油的含量为15-25%），将微孔板封好，放-70℃保存。 需要自己构建cDNA文库吗? 近几年，商业来源的成品cDNA文库的数量和质