纳豆激酶的分离纯化.docVIP

纳豆激酶的分离纯化? 摘??? 要 纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，分子量为28kD，等电点为pH8.6±0.3，在pH6.0-pH12.0范围内稳定。在此次实验中，在斜面培养基培养的纳豆激酶经过硫酸铵盐析法初步提取，然后以Sephadex G-75凝胶层析进行纯化，层析过程中收集洗脱液分别进行检测，分析各个峰值，最后对整个纯化方案进行评价。 关键词：纳豆激酶??? 硫酸铵盐析法??? 凝胶层析 1．前言 心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。 纳豆激酶是日本的传统食品——纳豆(natto)在发酵过程中产生的，是一种由纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[1-3]，该酶不但具有明显的溶栓活性，而且还可以激活体内的纤溶酶原，增加内源性溶纤酶的含量，具有降血压、抗氧化、抗肿瘤及溶血栓等医疗功效；且与传统的溶栓制剂相比，纳豆激酶有不易引起出血、无抗原性、半衰期长、安全无毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等优点[4]，因而具有广阔的开发前景，可能成为新一代的溶栓药物。自1987年Dr．Sumi首次从日本传统发酵食品纳豆中发现并可分离出纳豆激酶以来，该酶便受到世界相关研究人员的广泛关注[5]。 凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化[6]。凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万[7-8]，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。 凝胶层析收集洗脱液，经紫外分光光度计测定A280nm光吸收值，并绘制层析图谱。当出现第二个峰值过后即为实验终止，分析峰值数据，并以此对纳豆激酶纯化方案进行评价。 2．材料与方法 2.1 实验材料 1.1.1 仪器用具 紫外分光光度计，冷冻离心机，层析柱，离心管，比色杯，烧杯，试管，试管架等。 1.1.2 实验原料 ??? 纳豆激酶粗提液 1.1.3 实验试剂 ⑴ 硫酸铵饱和溶液：400g硫酸铵溶于预热的70～80℃ 500mL 蒸馏水中，搅拌2h左右，冷却至室温至底部有结晶析出，NH4OH调pH7.8。 ⑵ 0.2mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)： 0.2 mol/L? NaH2PO4????????????????????? 19 mL 0.2 mol/L? Na2HPO4????????????????????? 81 mL ⑶ 0.01 mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）： 0.2 mol/LPB ???????????????????????????50mL? NaCl????????????????????????????????? 8.5－9g 加蒸馏水至1000mL 2.2 实验方法 2.2.1 纳豆的制作 ??? 将实验室保存的纳豆菌种接入斜面培养基，经37℃、24h活化培养。挑取一环活化的菌种接种于营养肉汤中，37℃、120rpm过夜作为种子培养液。 ??? 纳豆制作：大豆→ 清洗、浸泡→ 高压蒸煮（121℃，30min）→ 摊凉→ 接种（5％）→ 发酵（37℃、24h ）→ 后熟（4℃、过夜 ）→ 成熟纳豆 2.2.2 纳豆激酶的粗提及盐析 ⑴ 浸提：取固体发酵新鲜纳豆，加入2倍体积的灭菌生理盐水，搅拌，浸提24h以上，浸提液7000r/min，冷冻离心15min，取上清液即为粗提液。 ⑵ 硫酸铵盐析：取35mL的纳豆激酶粗提液，一边搅拌纳豆激酶粗提液，一边加入15mL的硫酸铵饱和溶液，采用30％饱和度的硫酸铵进行盐析，放置1h后，7000r/min离心10min，弃去沉淀，得到37mL的上清液，取36mL的上清液加27mL的硫酸铵饱和溶液至60％饱和度，放置1h后，7000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀物，取5mL的0.2mol/L，pH7.4的PB溶解。 ⑶ 在盐析过程中，取1mL粗酶液，稀释40倍，取1mL 30％硫酸铵盐析上清液，稀释20倍，取60％硫酸铵盐析沉淀液，稀释20倍，经紫外分光光度计测定A280nm和A260nm的吸光值，并作记录。 2.2.3 Sephadex G-75凝胶层析进行纯化 ⑴ 凝胶的处理：称取10g Sephadex G-75于500mL的烧杯中，加入