提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率探究.docVIP

提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率探究 　　[摘要] 目的 探讨提高PC12细胞转染效率的方法。 方法 细胞培养板用10 μg/mLⅠ型牛胶原蛋白包被，通过在转染过程中加入9 μmol/L趋溶酶体试剂氯喹及8 μmol/L聚胺类试剂亚精胺，同时调整Lipofectamine2000与DNA用量的比例和转染时间。考察DNA与Lipofectamine2000的比例对PC12细胞转染效率的影响，转染时间对PC12细胞转染效率的影响，氯喹、亚精胺用量对PC12细胞转染效率的影响，氯喹、亚精胺对PC12细胞活性的影响，氯喹、亚精胺对PC12细胞神经轴突生长的影响及与4种常用脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率的比较。结果 ①对PC12细胞转染，DNA∶Lipofectamine2000用量比例应控制在1∶4。②当转染时间分别为1、2、4、8、24 h时，PC12细胞转染率分别为35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及38.6%，4 h达到最大转染效率。③氯喹、亚精胺加入浓度的增加，PC12细胞转染效率随之增加，当氯喹、亚精胺加入终浓度分别增至9 μmol/L和8 μmol/L时，PC12细胞的转染效率最高，转染效率为40.5%。④加入终浓度为9 μmol/L氯喹与8 μmol/L亚精胺前、后MTT试验吸光度（590 nm）分别为（0.466±0.042）与（0.451±0.038），差异无统计学意义（P 0.05），对PC12细胞的活性无影响。⑤加入氯喹、亚精胺前、后，PC12细胞的神经轴突生长数量与长度差异无统计学意义（P 0.05）。⑥FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000 4种脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率分别为10.5%、8.6%、11.8%及15.3%，本法PC12细胞转染率为40.5%，差异有高度统计学意义（P 0.05）. ⑤The differences of neural axon growth number and length before and after the chloroquine and spermine was not statistically significant （P 0.05）. ⑥PC12 cell transfection efficiency of FuGENE， PolyJet， Lipofectamine LTX and Plus， Lipofectamine2000 were 10.5%， 8.6%， 11.8%， 15.3% respectively； PC12 cell transfection efficiency of this method was 40.5%， the differences were statistically significant （P 　　[Key words] PC-12 cells； Lipofectamine2000； Cationic liposome/DNA compound； Chloroquine； Spermidine PC12细胞诱导产生的神经轴突能作为研究神经退行性疾病及脊柱损伤的研究模型[1-2]，也是研究神经内分泌试验的模型[3]。细胞转染技术是分子生物学及基因工程关键步骤之一[4]，也是体外研究神经细胞特定基因表达调控及遗传病基因治疗的重要技术之一[5]，但常用的阳离子脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率低[1，6-8]。本研究参照相关文献[8-10]，通过在阳离子脂质体转染过程中加入氯喹及亚精胺，同时调整阳离子脂质体转染试剂与DNA用量的比例和转染时间，实现提高PC12细胞转染率，且未影响细胞的正常功能，为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 主要试剂：PC12细胞（American Culture Collection），RPMI1640培养基（Sigma公司），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），FuGENE HD（Roche公司），PolyJet（Signagen Laboratoies公司），Lipofectamine LTX and Plus（Invitrogen公司），pEGFP-N1（BD Biosciences公司），氯喹（Sigma公司），亚精胺（Sigma公司），Ⅰ型牛胶原蛋白（BD Biosciences公司），神经生长因子（NGF）（Peprotech公司），噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）。Axiovert 100