白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和通路影响.docVIP

白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和通路影响 　　摘要：目的：探讨白藜芦醇（Resveratrol， Res）对大鼠脊髓损伤（Spinal cord injury， SCI）后细胞凋亡及通路的影响。方法 采用Allen’s脊髓打击损伤模型（T8），将27只SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）；损伤组（Control组）；白藜芦醇处理组（Res组），每组9只。术后72 h，应用透射电镜观察脊髓组织细胞凋亡形态变化，免疫组化及Western blot等方法检测脊髓组织中凋亡蛋白表达的变化。结果：透射电镜观察显示Res能明显抑制脊髓神经细胞的凋亡。免疫组化及Western blot检测显示Sham组Bcl-2、Bax呈极少量表达；Control组Bax大量表达（P 　　1.4 观测指标 1.4.1 电镜观察 术后72h各组取3只大鼠，给予过量乙醚麻醉处死后，取T8损伤节段脊髓组织损伤节段脊髓组织，将标本修成1 mm3的小块并置于2.5%戊二醛固定液中，4℃固定6 h；磷酸盐缓冲液冲洗（pH=7.4），1%四氧化锇固定1 h；依次用乙醇、丙酮逐级递增浓度脱水；环氧树脂包埋，70℃下聚合48 h；超薄切片机连续切片，片厚60 nm；用醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液进行双重染色；透射电镜观察、拍照。 1.4.2 免疫组织化学检测 术后72 h各组取3只大鼠，同法取 T8损伤节段脊髓组织石蜡包埋、5 μm 厚切片。常规脱蜡、后；热修复抗原；每张切片加50 μl内源性过氧化酶阻断剂，室温孵育10 min；PBS冲洗后，每张切片加50 μl正常非免疫动物血清，室温孵育10 min；甩去血清，每张切片加50 μl的兔抗鼠一抗：Bcl-2（1：100）或Bax（1：200）或Caspase-3（1：100）或p38MAPK（1：200），4℃过夜；PBS冲洗后，每张切片加50 μl生物素的羊抗兔IgG二抗，室温下孵育30 min；PBS冲洗后，每张切片加50 μl辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素溶液，室温孵育20 min。PBS冲洗后，每张切片加100 μl新鲜配置的DAB，显微镜下观察3 min，棕色为阳性；纯化水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。显微观察阳性表达位置及强度。 1.4.3 免疫印迹法（Westen blot）检测 术后72 h各组取3只大鼠，同法取 T8损伤节段脊髓组织，RIPA试剂盒提取总蛋白，10 000 g离心取上清，定量并分装；（4：1比例样品/上样缓冲液）混合样品100℃加热变性5 min；配制10%分离胶和4%浓缩胶，上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据 MARKER 的位置切胶，根据胶的大小裁剪 PVDF 膜和滤纸，并将膜和滤纸于转膜缓冲液中浸15 min，之后按滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸的顺序叠放于转膜板上夹紧，25 mV转膜2.5h；转膜后将 PVDF 膜蛋白面朝上于8% 脱脂奶粉液中 37℃ 封闭1 h。TBST漂洗三遍。弃去TBST，加一抗Bcl-2或Bax或Caspase-3或p38 MAPK（兔抗大鼠，1：200）；37℃摇床摇动2 h，4℃冰箱过夜；弃去一抗，TBST漂洗三遍；加二抗（HRP标记山羊抗兔IgG， 1：800）；摇床温和摇动3 h；弃去二抗，TBST漂洗三遍，共30 min；ECL发光液发光、凝胶成像系统采集及分析。 1.5 统计学分析 所得数据均以±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析， P 　　Caspases蛋白酶是目前研究的热点之一，它的激活被作为细胞凋亡的标志。在正常情况下，Caspase-3蛋白是以活性很低的酶原形式存在，Caspase-3被激活后，其构象发生变化，从而发挥凋亡效应，导致凋亡的发生[17]。研究发现[18]SCI后出现细胞凋亡、Caspase-3的激活等，继而脊髓内神经元发生一系列形态及功能变化。研究证实[19]，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。因此，SCI研究中Bax，Bcl-2，Caspase途径是极其重要的研究途径。有丝分裂原激酶（MAPKs）是一组参与介导细胞外信号由胞外向胞内传递的重要介质，它们在细胞分化、发育、成活和凋亡过程中发挥重要作用。p38MAPK的激活是SCI引起凋亡的重要信号转导通路之一，参与Bcl-2、Bax、iNOS和caspase有关细胞凋亡基因的调控。SCI激活p38MAPK，进而活化下游的转录因子、MAPKAPK2， 3及Caspase家族成员，活化的转录因子与顺式作用元件相结合，引起大量与凋亡有关的基因表达，与细胞延迟性死亡密切相关。 继发性SCI