郑雅匀-中国农业大学农学院.DOCVIP

中国农业大学 本科生“URP”立项申请书 项目名称 Aicda 基因敲除斑马鱼的构建 申 请 人 郑雅匀 工作单位 农学与生物技术学院 联系电话 电子信箱 zhengyayun@ 填表日期 2015.4.21 中国农业大学教务处制 项目名称 Aicda 基因敲除斑马鱼的构建 项目起止时间 2015年5月 ——2016年4月 项目申请人情况 姓名 郑雅匀 性别 女 出生日期 1995.8.18 最后学历与学位 本科在读 专业技术职务 学生 从事专业 农学 项目概况 生物的免疫系统分为先天性免疫和适应性免疫。先天性免疫是机体的第一道免疫屏障，当先天性免疫被突破则通过适应性免疫进行抗原的清除。B细胞以及其表达的免疫球蛋白是适应性免疫系统的重要组成部分，而在免疫球蛋白基因表达过程中，激活诱导胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）是一个非常重要的蛋白因子。 免疫球蛋白分为可变区和恒定区。可变区负责与抗原识别，需要大量的多样性，以达到和抗原紧密结合的目的。而抗体的功能则由恒定区决定。 AID由Aicda基因编码，能够导致DNA中的胞嘧啶脱去氨基，转化为尿嘧啶，形成U:G错配。在后续的修复过程中引发体细胞超突变（SHM）、基因转换（GC）和类别转换重组（CSR）等过程，改变B细胞表达的免疫球蛋白的可变区和恒定区，极大地丰富了免疫球蛋白可变区的多样性和恒定区的效应作用。 在低等的脊椎动物鱼类中，免疫球蛋白基因体细胞超突变发生频率非常低，而类别转换重组过程则没有被发现。为了研究脊椎动物早期进化过程中这些机制的作用，在研究中需构建Aicda基因敲除的斑马鱼。 Tübingen斑马鱼品系为科研中最常用的斑马鱼品系，斑马鱼具有养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases) 是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶它是实现基因敲除、敲入或转录激活等靶向基因组编辑的里程碑。 二、实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法) 1. 筛选TALENs 靶位点，了解TALENs 作用的基本原理、方式以及设计规则。 2. 构建针对斑马鱼Aicda基因的TALENs，了解TALENs的构建方法，同时学习克隆实验、质粒提取和载体构建。 3. 体外转录TALEN mRNA，掌握体外转录方法。 4. 显微注射TALEN mRNA，学习显微注射方法，并了解斑马鱼胚胎发育过程。 5. 筛选Aicda基因突变的斑马鱼F0代，学习斑马鱼的饲养，熟练进行PCR及相关操作，学会分析测序结果。 6. 获得Aicda基因突变的斑马鱼F1代，学会斑马鱼性别分辨并进行交配，熟练进行T-A克隆。 7. 获得Aicda基因突变的斑马鱼纯合子（F2代）。 三、项目实施的基础和条件 斑马鱼鱼房： 养鱼设备，恒温培养箱，解剖镜，显微镜，显微注射设备，斑马鱼饲料等。 分子实验室： PCR相关试剂及仪器，克隆实验相关设备及仪器，限制性内切酶，体外转录试剂盒等。 序列分析软件及网站： NCBI（），Ensembl（/index），DNA和蛋白质序列比对和序列编辑软件DNASTAR Lasergene 7.0， PCR 引物设计软件：PrimerPremier 5.0等。 四、学生提交的成果 获得Aicda 基因敲除的斑马鱼 五、经费预算 共约 8000元 TALEN 构建及转录 体外转录试剂盒 （mMessage mMachine AM1340）1盒 4600元； T-A克隆及PCR 2×Taq Master Mix（含染料）5包 420×5=2100元； pMD19-T vector （takara D102A）1盒 500元； 其他 实验所需tip头，离心管，PCR管等，培养基成分，工具酶等。 六、学院URP领导小组意见 签字 （盖章） 月 日 1