pBiG-CAR真核表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

第47卷 第 3期 哈尔滨医科大学学报 Vo1．47．N0．3 2013年 6月 JOURNALOFHARBINMEDICALUNIVERSⅡY Jun．，2013 201 pBiG—CAR真核表达载体的构建及鉴定 姜苗苗 ，申景岭 ，孙唐娜 ，王凤梅 ，王 帆 ，白景玉 ，卢少玲 ，张 烁h (1．哈尔滨医科大学附属第二医院 心血管病科；2．哈尔滨医科大学 组织学与胚胎学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081) [摘要] 目的 构建及鉴定pBiG．CAR真核表达载体。方法 提取C57BL／6胎鼠总RNA，逆转录合成 cDNA，经PCR扩增获得 CAR基因，与双酶切的pBlue质粒连接 ，经转化、蓝 白筛选及测序鉴定 pBlue— CAR载体构建成功。扩增 pBlue—CAR的CAR基因，经双酶切后与 pBiG质粒连接，构建pBiG—CAR真核 表达载体。结果 经琼脂糖凝胶电泳，获得 目的基因CAR条带，pBlue—CAR 目标条带及pBiG．CAR 目标 条带。基因测序证实所检测重组质粒序列与 pBiG．CAR序列完全一致。结论 克隆 C57BL／6鼠CAR 基因、pBlue—CAR重组质粒的构建获得成功，并初步证实pBiG—CAR真核表达载体的构建获得成功，为进 一 步构建可控心肌特异性 CAR过表达转基因鼠提供基础。 [关键词] 柯萨奇病毒一腺病毒受体；C57BL／6鼠；pBiG质粒 ；载体构建 [中图分类号]R394 [文献标识码]A [文章编号]1000—1905(2013)03—0201—04 ConstructionandidentificationofpBiG-CAR eukaryoticexpressionvector JIANGMiao．miao ，SHENJing1ing，SUNTang—na ，WANGFeng—mei，WANG Fan ，BAI Jing．yu ，LUShao．1ing，ZHANGShuo (1．DepartmentofCardiology，TheSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity；2． DepartmentofHistologyandEmbryology，HarbinMedicalUniversity，Harbin150081，China) Abstract：0bjective ToconstructpBiG-CAReukaryoticexpressionvectorandidenti~ it． Methods Total RNA waspreparedfrom hea~soffetalC57BL／6micetoobtainthecDNA by reversetranscriptionpolymerasechainreaction(PCR)．TheDNA ofcoxsckievirus—adenoviurs receptor(CAR)wasamplifiedusingPCR，andwasdoubledigestedbyenzymestobeligated withpBlue．TherecombinantvectorpBlue-CAR wasidentifiedbybluewhitescreeningwith transfromationand DNA sequencing．To ligate DNA with pBiG，CAR wasamplifiedrfom pBlue—CAR usingPCR anddoubledigestedbyenzymes．Results Th eobtainingoftargetgene CAR wasconfirmed through electrophoresisanalysis．Th e gene band ofrecombinantvector pBlue．．CAR andpBiG．．CAR wasconfimr edbyrestrictionenzymedigestionandelectrophoresis analysis．Thesequenceofrecombinantvectorshowedon difference，ascomparedwithpBiG— CAR byDNA sequescing．Conclusion TheDNA ofCAR issuccessfullycloned．ThepB