201009-3蛋白质通性纯化和表征.ppt

等电聚焦电泳法测定蛋白质pI MOV: MCB4.0\SDSD gel in proteomics 2、离子交换层析法：P37 纤维素离子交换剂： 交联葡聚糖离子交换剂：兼有分子筛效应 交联琼脂糖离子交换剂： 交联葡聚糖离子交换剂 （四）根据选择性吸附的差异：吸附层析法 极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 非极性：活性炭（范德华力、疏水作用） 最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高 （五）根据疏水性的差异： 疏水层析和反相HPLC 1、疏水层析 层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex) 洗脱： 低盐高PH 非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇） 2、反相HPLC 固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、C18硅烷 （六） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析 五、? 蛋白质的大小与形状 测分子量的方法： ★化学组成法测定最低分子量 ★SDS法 ★凝胶过滤法 ★渗透压法 ★扩散系数法 ★沉降系数法和沉降平衡法 第三章 蛋白质的通性、纯化及表征 一、? 蛋白质的酸碱性质和等电点 ★ 等电点 ★等离子点： 中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42-）影响滴定 曲线形状和等电点。 盐离子浓度为0时的等电点称等离子点 ★等电点测定 溶解度法 聚焦电泳法 二、?蛋白质的胶体性质与选择性沉淀 p31 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，不能通过半透膜） 1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜 ②非等电状态时，同种电荷的互相排斥。 ③质点大小在1-100nm，可以进行布朗运动 2、选择性沉淀蛋白质的方法 P31 ①盐析法：大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等。 ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法 3、蛋白质的变性 理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失。 （2）蛋白质变性后，往往出现下列现象： ①生物活性丧失 ②硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。 ③溶解度降低、沉淀，粘度增加。 （3）变性的实质： 次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。 变性不涉及一级结构的破坏 （4）可逆变性与不可逆变性 ★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。 三、蛋白质分离纯化的一般原则 P32 纯化的实质 增加制品(preparation)的纯度或比活力 一般程序： 前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存 电泳 前处理 粗分离 细分离 生物组织 无细胞提取液 破碎、溶 解、差速离心 选择性沉淀法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等） 亲和 层析 离子交换层析 精制后的蛋白质 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附层析 1、前处理： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机（waring blender) 匀浆器（homogenizer) 超声波处理（ultrasonication) 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理 （