根癌农杆菌介导法课件.ppt

植物基因工程 ——根癌农杆菌介导法 ——农杆菌 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 ——原理 根癌农杆菌的细胞内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。 因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。 ——Ti质粒结构特点 转移到植物基因组中的DNA序列，与肿瘤形相关。 激活T-DNA的转移，使植物致瘤，是毒性区。 调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移，是接合转移编码区。 调控Ti质粒的自我复制，为复制起始区。 ——Ti质粒的改造策略 由于野生Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在许多障碍，故对野生型Ti质粒可以采取两种不同的改造策略——一元载体系统和二元载体系统。 相较而言，二元载体更多优点： 1、构建方便；2、效率高；3、不会带人大量无用的冗余DNA序列。 ——一元载体（卸甲载体） 切除T-DNA中的致瘤基因，仅保留两侧边界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。 在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中间载体同源的质粒序列。 用特定转移方法转移中间载体，发生同源重组。 根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。 用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。 ——二元载体 基本原理：T-DNA区与Vir区不在同一个载体上，Vir区通过反式作用使T-DNA区发生转移。 微型Ti质粒 根癌农杆菌 辅助Ti质粒 外源基因 微型Ti质粒 含有辅助Ti质粒的根癌农杆菌 植物 ——T-DNA导入植物基因组的过程 一、农杆菌对受体的识别 菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋向性。 二、农杆菌附着到受体细胞 创伤部位生存了8~16h（细胞调节期）的菌株才能诱发肿瘤。期间，农杆菌产生纤丝将自身缚附在植物细胞壁表面。 三、诱导和启动毒性区基因表达 把植物受伤细胞提取液加入培养基，Vir区基因均被诱导和活化。 Vir接收信号 VirA编码受体蛋白（受体蛋白与化学信号分子结合） C端活化（具激酶功能，使组氨酸残基磷酸化）VirA蛋白被激活（转移其磷酸基团至Vir蛋白)Vir族蛋白活化 四、类似接合孔复合体的合成和装配 五、T-DNA的加工和转运 六、T-DNA的整合 ——影响T-DNA转移的因素 农杆菌菌株 菌株侵染力：农杆碱型菌株胭脂碱型菌株章鱼碱型菌株 农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 一般用0.3~1.0OD农杆菌菌液接种植物材料 基因活化的诱导物 常用诱导物：乙酰丁香酮（AS）、羟基乙酰丁香酮（HO-AS) 外植体的类型和生理状态 发育早期的组织细胞具有很强的分裂能力，这些组织发生创伤活环境诱导时，加速分裂，处于转化的敏感期。 外植体的预培养 一般为2~3天 作用：促进细胞分裂；使外植体适应于试管立体培养的条件；有利于外植体能与培养基平整接触。 外植体的接种及培养 一般接种时间1~30min 接种菌液浓度0.3~1.5OD ——基因枪法Vs农杆菌法 * * * * * * Ti-质粒的基因结构 T-DNA区 （transferred DNA region) Vir区 （virulence region) Con区 （region encoding conjugation) Ori区 （origin of replication) 缺失Vir，T-DNA卸甲，引入酶切位点 去掉T-DNA去 低 复杂 单子叶植物；一些双子叶植物 高 根癌农杆菌介导法 高 简便 无限制 低 基因枪法 可 控度 操作 宿主 范围 转化 效率