第五章 蛋白质分离、纯化.ppt

; （一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离 （二）粗分级 （三）细分级 ;蛋白质粗分级;二、有机溶剂分级沉淀 有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 优点：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。 缺点：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格低温。;三、超速离心法 在强大的离心力的作用下，溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而使溶液和沉淀物质分开。;五、透 析;五、透 析;六、超滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质;一、凝胶层析;凝胶层析;带网孔的葡聚糖珠; 凝胶的前处理; ;样品上柱、洗脱、收集 ;凝胶的再生及保存;二、离子交换层析;离子交换层析;阳离子交换层析过程;离子交换层析;三、亲和层析;;电泳法;1．原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N?，N?-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。;聚丙烯酰胺凝胶优点 化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感； 重复性好； 灵敏度高，可达10-6 g； 分辨率高。;分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 ;垂直板电泳;垂直板电泳;垂直板电泳;蛋白质微型电泳系统;SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;实验方法：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;蛋白质含量测定与蛋白质鉴定  在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。 ;蛋白质含量测定;蛋白质鉴定;（一）蛋白质纯度鉴定： 目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法，电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比来表示目标蛋白的纯度。 ;（三）蛋???质氨基酸组成及顺序分析 ;（四）蛋白质结晶与结构分析 ;（五）蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴定 ; 电转移结束后，取出硝酸纤维素滤膜，进行抗原抗体显色反应。硝酸纤维素滤膜上的抗原抗体反应原理如图 ： ;（六）蛋白质生物活性及功能测定 ;谢 谢！