第十一章 基因工程0910.ppt

第十一章 基因工程 ;年份 1970 1972 1974 1975～1977 1977 1978 1981 1982 1988 1989 ? 1990-1992 1994 1997 2000 2001 ;基因工程在医学中的应用举例 1. 基因工程药物 干扰素——治疗病毒性感染和肿瘤 全血中105 U/L 基因工程产物1022 U/L发酵液 人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)——溶血栓药物 在人、动物组织中含量极微 乙肝病毒疫苗——克隆和表达表面抗原基因 具有更高的安全性 ; 2. 基因工程抗体 鼠源单抗人源化——减少或消除作为异源蛋白诱发的人抗鼠抗体 制备小分子抗体Fab、单链抗体等 制备抗体融合蛋白——导向治疗，如毒素、酶、细胞因子 3. 基因工程疫苗（核酸疫苗） 去除毒力相关基因使丧失致病性，但保留免疫原性，构建重组质粒，在宿主体内表达，可激发长期而有效的免疫应答。 无减毒、灭活疫苗可能引起的致病性 4. 基因治疗 ;概念：;;第一节 基因工程常用的工具酶 ;特 性 ;2 识别位点：回文序列（palindromic sequence）;酶切结果：;;3.影响内切酶活性的因素 在适当反应条件下（包括温度、pH、离子强度等），1小时内完全酶解1 μg 特定DNA底物（即λDNA）所需要的限制性内切酶的量，定为1个活性单位。 λ噬菌体DNA（λDNA）作为底物测定其活性单位。 质量要求主要包括：①不存在任何其它核酸内切酶或外切酶的污染；②长时间酶解不出现识别序列特异的下降；③酶解的DNA片段再连接后能被重新识别并切割等技术指标。 ;（1）DNA的纯度 蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸钠）、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制内切酶的活性。 （2）DNA分子的结构和构型 甲基化会阻止限制酶的切割 切割超螺旋的质粒DNA或者病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍 （3）酶切反应的温度与时间 不同的限制酶具有不同的最适反应温度 酶解时间可通过加大酶量而缩短 不同的DNA底物在一定酶量和一定时间内，其酶解效率不一 ;（4）反应缓冲液 10倍酶解缓冲液 反应缓冲液中的主要成分为Tris·HCl、NaCl和Mg2+ 大多数要求的pH范围在7.2~7.6之间 离子强度可分为3个级别：即低盐（10 mmol/L NaCl）,中盐（50 mmol/L NaCl）和高盐（100 mmol/L NaCl） β-巯基乙醇(2-ME)——防止酶的氧化 牛血清白蛋白（BSA）对于某些内切酶是必需的 ;;二．DNA连接酶 ;连接方式： （1）具有互补粘性末端的DNA片段——用E.coli DNA连接酶 （2）平末端的DNA片段的连接： A. 用T4 DNA连接酶直接连接 B. DNA连接酶连接;三．DNA聚合酶;大肠杆菌DNA聚合酶：;DNA聚合酶I ;缺口转移;2. DNA聚合酶I大片段（Klenow酶） ;4. Taq DNA聚合酶 源于水生栖热菌（Thermus aquaticus, Taq） 特点： 较高的热稳定性，95℃ 具有5’?3’聚合酶活性，无外切酶活性 在高温（70 ~ 80 ℃）中进行反应， 用途： 可克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响 ;5．反转录酶（reverse transcriptase） 依赖于RNA的DNA聚合酶 具有5’?3’聚合酶活性。 源于RNA肿瘤病毒 ;二．其他工具酶 ;2. 碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶 （BAP） 小牛肠碱性磷酸酶（CIP） 催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，使DNA、RNA、NTP、dNTP的5’-P 转换为5’-OH;;3．T4多核苷酸激酶 催化ATP上的γ-P转移到DNA或RNA 的5’- 末端羟基上 ;4．核酸外切酶 （exonucleases） 属于核酸酶： 水解磷酸二酯键 从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核苷酸： 5’→3’ 或 3’→5’ 单链的核酸外切酶：底物——单链 双链的核酸外切酶：底物——双链;5．S1核酸酶 高度单链特异的核酸内切酶 催化RNA或单链DNA的降解，产生带5’-磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸 ①切断cDNA合成过程中形成的发夹结构。 ②从限制酶消化产生的粘性末端中切去单链突出序列，形成平末端。 ③分析DNA/RNA杂交体的结构，证明内含子的存在。 ;常用工具酶的分类 ：;第二节 基因工程的操作过程及原理 ;二．载体（Vector）的选