第九章 基因分离与克隆-.ppt

第九章?????? 目的基因的分离和克隆;第九章?????? 目的基因的分离和克隆;目的基因; ;第一节??????? 目的基因的获得;一、基因的化学合成法;1.化学合成法的基本策略;②补丁延长法： ;③大片段酶促法： ;上述三种方法各有利弊： 化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则合成50个碱基的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。;;某段连续的氨基酸序列所有可能的DNA序列 ;简并序列少，更适合做探针;;化学合成的单元操作;3.基因化学合成的优点 可以合成细菌偏爱的密码子 可以定向改变个别氨基酸 可以在两端加上需要的限制酶切点 可以通过自动化仪器合成;;二、PCR法克隆目的基因;PCR技术反应周期包括三个步骤： 高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分离为单链，作为模板。（91℃，1分钟）。 低温退火：（约50℃，1分钟）使专门设计的一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板DNA两端的互补区段互补结合。 适温延伸：将反应混合物的温度上升到72℃，保温1分钟。;31; PCR原理图 ;3. 特点： ⑴ 反复循环便于获得大量的基因拷贝 ⑵ Taq酶作用下每一轮PCR循环会产生10－3～10－4的错配率, 所以多用于基因检测，如果用于基因重组表达，在此之前必须进行DNA序列分析。;1. 基因文库的基本概念;（2）基因文库构建的基本策略;;;（4）基因文库的完备性;若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。;（5）基因文库的质量标准;（1）基因组DNA的制备;（2）基因组DNA的切割;（3）载体和受体的选择;在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！ 方法一：粘末端连接 方法二：人工接头法;（6）从基因组文库中筛选目的基因;密集铺板（1-10万）;(7).利用改进的鸟枪法操作克隆目的基因;例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。;冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法;(8).鸟枪法克隆目的基因的局限性;（9）基因组文库构建的技术性问题;（10）构建基因组文库应注意的问题;4、连接--在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于1×106~6×l06。 5、包装抽提物的包装效率：贮存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。;基因组文库构建程序 随机酶切成较大的DNA片段（10-30 Kb，平均20 Kb)，对这些片段进行分离 重组入适当载体（噬菌体） 转化进宿主菌（E.coli)，扩增，构建成基因文库 从基因组文库中筛选出含有目的基因组的重组子。; 是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。 cDNA的克隆对于特定基因的分离和特性研究是极有价值的工具。 cDNA文库最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。;特点： cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操作更为方便。 mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特定功能基因工作量较小。 mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板。（转录特征） 可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 不能研究基因组的结构功能;mRNA;反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒） MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物 Oligo（dT）引导的 cDNA 合成 是指 Oligo（dT）引物与