第十七章 重组DNA技术.ppt

第十七章重组DNA技术;第一节 DNA的重组 DNA Recombination;一、同源重组 ;;; 质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。;可接合质粒，如 F 因子(F factor);（二）转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 ;（三）转导作用(transduction)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。 ;;第二节 重组DNA技术;一、重组DNA技术相关概念; 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。;;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等;（二） 工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶I 逆转录酶 T4DNA 连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 ; 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 ;Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构;BamHⅠ;（三）目的基因（又称外源DNA） cDNA：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。 基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。;（四）基因载体（克隆载体）：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA; 克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。 常用的载体： 质粒、噬菌体DNA、病毒DNA ;载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于 重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。;1.　质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 ~ 3个抗药性基因，以利于筛选。;2.噬菌体（phage）DNA λ 噬菌体DNA改造系统 λ gt 系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因） M13mp系列 pUC系列;3.　其他 　　 柯斯质粒（cosmid） 酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理及步骤;;　;　;;（三）外源基因与载体的连接;;　; 3、cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNA library）。;组织或培养细胞;　;　;（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA;载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。;1、粘性末端连接： 同一限制酶切割位点连接 配伍末端连接 ;;;2、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端 3、同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 ;;4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。;;（四）重组DNA导入受体菌： 受体菌条件: 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 ;导入方式：转化 (transformation) 转染 (transfect