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除草剂组合靶标筛选探究 　　摘要：主要研究了几种单、双子叶植物种子在人工环境条件下的发芽率及对几种常用溶剂的反应，并选用了几种合适的种子以及小球藻（Chlorella vulgaris）、浮萍（Lemnaceae）对9种除草剂进行了除草活性试验。结果表明，不同备选靶标在室内人工环境适应性及对除草剂活性反应均不同；综合比较各备选靶标的发芽率、培养温度、对常用溶剂及除草剂的敏感性等因素，确定了几个可用于除草剂组合筛选的靶标。以组合靶标方式建立的除草剂筛选流程提供的是一个多重筛选模型，可减少对低活性先导化合物的漏筛。近3年来对30 000多个微生物源提取物的筛选结果表明，运用组合靶标是一种稳定、高效的除草活性筛选模式。 关键词：组合靶标；除草活性；微生物源提取物；模式靶标 中图分类号：S482.4 文献标识码： A 文章编号：0439-8114（2013）23-5757-03 除草剂筛选作为新药发现中的一个重要部分，必须有选择性地针对单、双子叶杂草进行大规模的筛选，同时由于样品中有效成分含量普遍较低，为了避免对低含量或有潜在活性的先导化合物的漏筛，使用组合靶标是最高效的方法。使用组合靶标模型进行筛选，不仅可以提高筛选的敏感度，减少漏筛，而且不会受到使用杂草进行除草剂筛选的资源少、耐药性不稳定、季节性差异等方面的限制。因此，构建适用于各种类型除草剂的多重筛选网，可以提高筛选效率、突破资源限制、减少漏筛。本试验通过比较几种单、双子叶植物对除草剂敏感程度及高通量筛选的可操作性，选取了几种容易获得的单、双子叶植物及对除草剂高度敏感的浮萍（Lemnaceae）、小球藻（Chlorella vulgaris）组成组合靶标。该组合靶标具有对除草剂敏感度适中、易获取、可操作性强、不受季节限制等优点。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 备选靶标 红苋菜（4个品种）、白苋菜（3个品种）、狗芽根（2个品种）、早熟禾（4个品种）、高羊茅、油菜、生菜、油麦菜、浮萍、小球藻。种子保藏温度为5～7 ℃。 1.1.2 琼脂粉 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，型号为DH010-4。 1.1.3 试剂及标准样品 用于靶标杀菌试剂：75%酒精、2%次氯酸钠溶液。常用溶剂：丙酮、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、吐温80，以上试剂均为分析纯化学试剂。除草剂：乙草胺、草甘膦异丙胺盐、氟吡甲禾灵、精异丙甲草胺、精喹禾灵、氯氟吡氧乙酸、水花生必杀（复配）、2-甲-4-氯钠、2-甲-4-氯二甲胺盐，为市售商品化除草剂。 1.1.4 供筛选试验样品 放线菌、真菌发酵提取物及微生物源先导化合物由湖北省生物农药工程研究中心微生物工程研究室提供。 1.1.5 主要仪器设备 B100-1F蠕动泵、BIOHIT eLINE（MCE8k）电子移液器、High Tech Lab DV8-200移液器、96孔深孔组织培养板、96孔浅孔组织培养板、24孔组织培养板、日光灯管组（0.4 m距离，光照度为3 500-4 000 lx）、人工气候室（光、温、湿可调）、无菌操作台。 1.2 试验方法 1.2.1 种子杀菌处理、培养基制备、培养试验[1] 植物种子先用75%酒精浸泡30 s，再经2%次氯酸钠溶液浸泡10 min，最后用无菌水反复浸洗，以达到清除种子表面碱液为准。在无菌操作台中晾干备用。把经过高压灭菌后的0.7%的琼脂加入96孔深孔板（植物种子培养基质），每孔加入量1 mL，冷却后备用；把以无菌水配制的培养液加入96孔组织培养板（小球藻培养基质，小球藻细胞浓度为30万～40万个/mL）及24孔组织培养板（浮萍培养基质），每孔加入量分别为0.2 mL和2.0 mL。在作为载体的琼脂表面接入经杀菌处理的植物种子，接入量为20粒/孔。在加入培养液的24孔组织培养板中移入一株3叶龄的浮萍。 1.2.2 常用溶剂对植物的影响试验 把丙酮、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇分别制备成10.0%、5.0%、2.5%、1.0%、0.5%的母液，吐温80制备成0.20%、0.10%、0.05%的母液。在加入了受试靶标的各组织培养板中加入各溶剂的不同浓度的母液。组织培养板加盖后移入人工气候室培养，培养温度同各靶标发芽试验温度、相对湿度为70%～80%、光照14 h/d。每个浓度设2个重复，试验重复3次。7 d后检查溶剂对靶标生长的影响结果。 1.2.3 除草剂对植物种子的活性试验 1）活性评价指标：根据活性反应的不同，使用两项指标标记除草活性。第一项以植株长势（株高）为指标进行标记，按0、3、5、7、9分级。对于植株株高明显高于阴性对照的样品标记