重组体筛选和鉴定.ppt

本章教学目的和要求： 掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Western blotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道基因筛选法。 重点： 常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA） 难点： 免疫印迹（Western Blotting）法的原理 外源DNA 蓝白菌落 噬菌斑(plaque) 筛选植物转化细胞常用的报告基因 报告基因（reporter gene）：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 ①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。 ④β-葡萄糖酸酶基因（GUS） GUS的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。 尤其是GUS基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。 ⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC） LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。 Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，Luc是一种理想的报告基因。 ⑥抗除草剂bar基因 bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。 ⑦冠瘿碱合成酶基因 主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。 冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。 冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（TK） -- 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） -- 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRT） 胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。 这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有这些基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。 根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。 SouthernBlotting 原位杂交筛选DNA重组体图解 Northern Blotting Western Blotting Southern和Western印迹法 筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 一、原理： 二、利用插入序列提供的表型特征筛选 1.弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。 DHFR 载体 连接 转化受体菌 三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板 含DHFR的克隆才能生长 例： 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 增加新性状 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转