反相高效液相色谱法测定牛黄上清胶囊中胆红素含量.docVIP

反相高效液相色谱法测定牛黄上清胶囊中胆红素含量 　　【摘要】目的为牛黄上清胶囊中胆红素含量的测定建立起反相高效液相色谱的测定方法。方法固定相：Hypersil BDS C18柱（4.6mm ×250mm，5μm）；流动相：二甲基亚砜-乙腈（13.5：6.5）；检测波长：450nm；流速：1.0 mlmin-1。结果胆红素在1.6μg/ml-40μg/ml 之间呈现良好的线性关系（r=0.9999）；胆红素的平均回收率（n=6）98.94%（RSD=0.573%）。结论该测定方法专属性强，准确、有效，可作为市售牛黄上清胶囊质量控制的方法之一。 【关键词】RP-HPLC；牛黄上清胶囊；胆红素含量 牛黄上清丸是中医治疗湿热证的经典方剂之一，首载于明代李梃的《医学入门》，具有清热泻火、散风止痛之功效。可用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、咽喉肿痛、目赤耳鸣、口舌生疮等症[1]。 根据90版的《中国药典》所载牛黄上清丸剂，经改造所成的一个中药新药制剂――牛黄上清胶囊。其处方由牛黄、菊花等19味常用的中药材所组成，处方中的君药为人工牛黄，其主要有效成分主要为胆红素[2-3]。现在，对胆红素的含量测定方法主要有：紫外分光光度法、RP-HPLC和HPLC等。本研究对牛黄上清胶囊中所含的胆红素进行了含量测定，运用的方法为反相高效液相色谱法，以期为牛黄上清胶囊提供反相高效液相色谱法的质量控制标准。 1仪器与试药 1.1仪器高效液相色谱仪：Agilent1200泵。色谱柱：Hypersil BDS C18。 1.2试药牛黄上清胶囊（市售）；胆红素（批号：10077-200503，中国药品生物制品检定所提供）；研究中所用的水为超纯水，乙腈为色谱纯，各试剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1色谱条件色谱柱使用Hypersil BDS C18柱（4.6mm ×250mm，5μm）；流动相为：二甲基亚砜-乙腈（13.5：6.5）溶液；流速为：1.0 mlmin-1；检测波长为：450nm。 2.2溶液的制备 2.2.1对照品溶液制备将胆红素对照品经过五氧化二磷干燥至恒重后，精密称取，置于100ml棕色量瓶中，加入二甲基亚砜-乙腈（7：3）溶液使其完全溶解，并将其稀释至刻度，摇匀后，制备成每1ml溶液含有胆红素40μg，即得。 2.2.2供试品溶液制备精密称取市售牛黄上清胶囊内容物0.3g，置于25ml的棕色量瓶中，加入二甲基亚砜-乙腈（13.5：6.5）溶液20ml，精密称定其重量，经超声处理10min后放冷，再次称定重量，用二甲基亚砜-乙腈（13.5：6.5）溶液补足其失重，摇匀后过滤，取滤液备用，即为供试品溶液。 2.2.3阴性样品溶液的制备量取牛黄上清胶囊的阴性对照品，制备方法参照供试品溶液方法来制备阴性样品溶液。 2.3线性范围考察精密量取对照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0和25.0ml，分别置于25ml棕色量瓶中，加入二甲基亚砜-乙腈（13.5：6.5）溶液稀释至刻度，摇匀后，即可获得6个浓度的对照品溶液。各浓度分别精密吸取10μl的溶液注入高效液相色谱仪中，依据正文中所述的条件测定峰面积，其中纵坐标表示峰面积积分值（A），横坐标表示进样浓度（C），做出标准曲线，其回归方程为A=6436422C-10755，r=0.9999。结果显示，胆红素在1.6μg/ml-40μg/ml之间浓度时呈现出良好的线性关系。 2.4专属性考察观察供试品溶液的反相高效液相色谱图，其胆红素峰的峰型对称、分离度好（计算得其理论塔板数为6971，对称因子为1.03，分离度为R=8.73）。 2.5精密度试验量取上文给出取线性条件下的4号对照品溶液，连续进样6次，根据文中色谱条件进行测定，结果显示RSD为0.87%。 2.6稳定性实验取市售牛黄上清胶囊内容物依法制备成供试品溶液，于室温下放置，分别在0，1，2，4，6小时时依法进行测定，每次进样10μl，记录峰面积。其峰面积峰RSD=0.79%，表明供试品溶液在6h内稳定。 2.7回收率实验采用加样回收的方法，取已知含量的牛黄上清胶囊（胆红素含量为3.012mg/g）内容物适量，大约为0.15g，之后再进行精密称定，记录数据后放置于棕色量瓶中，精密加入胆红素的对照品溶液10ml，之后再精密加入二甲基亚砜-乙腈（13.5：6.5）溶液10ml，同样的方法制备6分，依法测定，计算回收率，其平均回收率为98.94%，RSD=0.573%。 2.8含量测定取本次所购市售的牛黄上清胶囊，依照上述方法进行含量测定，测定6次，其平均胆红素含量为0.728mg/粒。 3讨论 人工牛黄为牛黄上清胶囊中的主