石斛总DNA提取.pptxVIP

石斛总DNA提取 步骤 一、材料 二、DNA提取方法 三、DNA检测 四、注意事项及改进方法 材料 实验共用两种石斛，其一是铁皮石斛，其二是霍山石斛。均采自于霍山县太平畈乡。 DNA提取方法 welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 1、打开水浴锅，检查水位，调节温度至65℃，预热2x CTAB提取缓冲液； 2、取干燥25-50 mg植物组织材料至2.0 mL 离心管中，加入灭菌的磁珠在球磨机上粉碎组织； 3、向管内加入900 μL预热（65℃）的CTAB提取缓冲液，再加入10 μL（1d）β-巯基乙醇和少许PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)，置于65℃水浴保温40-90 min，其间翻动摇2-3次混匀； DNA提取方法 welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 4、冷却至45℃以下，加等体积的氯仿/异戊醇，温和摇动使之混匀，使成乳状液。室温，12000 rpm离心10min； 5、静置分层后，将700μL上层清液吸入另一干净的EP管中，加入700μL氯仿/异戊醇，温和摇动使之充分混匀。室温，12000 rpm离心10 min； 6、吸取500 μL上清至一干净的1.5 mL Ep管中，加入330 μL异丙醇（约占上清液的2/3体积），-20℃放置30 min； 7、高速冷冻离心机调至4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清； 实验的问题 在石斛总DNA提取过程中常出现杂质干扰DNA纯度的现象，如含有酚类杂质的DNA沉淀物多成黄色或者褐色难以溶解于TE液或双蒸水中。 石斛由于含有较多的多糖，因此在提取中多糖常与DNA一起沉淀，这种沉淀会难溶与水因此会影响PCR扩增。 实验所采用的改良版CTAB法步骤多，操作繁杂，容易在实验过程中被外源DNA所污染。 改进方法 为了得到质量较高的总DNA在选取材料时尽量选取幼嫩的叶组织。 DNA对剪切力极为敏感，为了得到尽可能大的片段，在提取过程中药尽量简化操作步骤如减少转移DNA次数，离心时间等。 提取过程中应温和操作，避免剧烈震荡。用较粗枪头吸取上清液时注意不要产生气泡。 Thank you!