多重荧光PCR毛细管电泳进行微卫星不稳定性分析中的常见问题.PDF

Clin Pathol2008 ·619· 临床与实验病理学杂志J Exp Oct；24(5) 多重荧光PCR．毛细管电泳进行微卫星不稳定性 分析中的常见问题 wWw．maXIm．COm．Cn 潘菲1’2，宋坤1，盛弘强1，来茂德1 关键词：微卫星不稳定性；多重荧光PCR；毛细管电泳 1关于相对荧光信号强度 中图分类号：R394 文献标识码：B 文章编号：1001—7399(2008)05—0619—06 及真核生物基因组中具有高度多态性的短的串联重复核苷 微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)作为肿 酸序列…。MSI是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星 瘤发生相关机制之一，其检测已广泛应用于多项研究。利用 由于复制差错引起的简单重复序列的插人或缺失而造成的 多重荧光PCR结合毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE) 微卫星长度的任何改变，表现为结构性等位基因的大小发生 技术检测微卫星是一种具有优势的方法。它有高效、稳定、 改变，即出现新的微卫星等位基因现象BJ。 灵敏度高、分析结果可靠等优点。但由于多重荧光PCR．毛 微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后经遗传分析仪毛 细管电泳是一项精度要求相对较高的检测技术，因此实验操 细管电泳进行基因组扫描，通过检测片段长度来判断微卫星 作中不少细节是影响检测成败的关键冈素，并可能引起微卫 不稳定性。电泳图横坐标代表PCR产物及内标的碱基数， 星数据分析的误解。本文结合实例，对这项方法在使用中的 000 纵坐标代表相对荧光信号强度，范围在100到9RFU之 一些常见问题进行探讨，并就相关技术优化等方面做一简要 间¨1(图1)。荧光强度太高或太低均可能引起数据偏差。 介绍。 图1举例结肠黏膜组织的5个微卫星位点多重荧光PCR产物毛细管电泳 160．200 5个微I=!星位点。分别采用绿、蓝、黄(在软件中为醒目而显示黑色)3 bp)。从左始依次为D5s346，BAT26，BAT25．D17$250和D2S123 种不同颜色的荧光染料，同色引物扩增产物长度有别。括号内数字表示各位点产物预期长度(检测发现个别样本的某些微卫星位点片段长度 与NCBI或文献报道的数据不符。这种现象是由于缺乏在不同的种族和群体中足够的野生型等位基因可变长度的相关资料引起的) 1．1扩增目标位点无荧光信号可能原因及解决方案：(1) 收稿日期：2008—05—27 基金项目：浙江省科技厅国际合作项目(2007C24009)，浙江省科技 Size 据能通过，LIz Standard内标(用于校正片段的大小)能 厅重大科技专项和优先主胚项目(2007C13020) 正常显示，但无目的位点的峰，且原始数据图中也无目的峰。 作者单位：1浙江大学医学院病理学与病理生理学系。杭州310058 可以将PCR产物进行普通凝胶电泳再作验证。解决的办法 2杭州师范大学基础医学部，杭州310036 是检查PCR体系中的各种成分以确保PCR扩增有效。(2) 作者简介：潘菲，