免疫组织化学检验技术课件.pptVIP

2.显色强度 特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔 而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞 3.其他 在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色 六、质量控制 质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。 （一）试剂质量控制 抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键 （二）操作过程质量控制 实验操作 标本的质量控制 （三）仪器设备和器具的质量控制 第二节 酶免组织化学检验技术 酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。 一、标本制作 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片 酶免组织化学检验技术可分为 酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法 二、酶标记抗体的免疫组化染色法 （一）原理 酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、定位、定量检测的目的。 （二）技术类型 1.直接法 形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法 形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法 形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物 （三）方法评价 三、非标记抗体酶免疫组化染色法 （一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。 （二）技术类型 1.酶桥法 用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色 2.PAP法 即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶（P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。 通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连接起来 3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。 4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。 （三）方法评价 该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。 四、临床应用 酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。 第三节 荧光免疫组织化学检验技术 利用抗原抗体特异性结合的原理，先用荧光素标记已知抗体并以此作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后，即会发出一定波长的荧光，进而对组织中的某种抗原进行定性、定位和定量分析。 一、标本制作 常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三大类，按不同标本性质可制作涂片、印片或组织切片等。 （一）载玻片和盖玻片的处理 载玻片和盖玻片要厚薄均匀、洁净及透光性好 （二）制片 1．组织切片 组织材料可制备成冰冻切片或石蜡切片。 2．印片 组织材料也可制成印片。 3．涂片 细胞或细菌要制成涂片，涂片应薄且均匀。