原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定.pptVIP

操作步骤 通过PCR或RT-PCR获得目的基因 构建重组表达质粒 获得含重组表达质粒的表达菌种 诱导表达  亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 不溶性包涵体的提取 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm离心1min集菌，PBS洗涤菌体2-3次，然后用Buffer A（一般用1/10体积）重悬菌体，超声破碎至清亮。 4℃ 12000rpm离心20min，弃上清。 用PBS洗涤沉淀2-3次。 往沉淀中加19.7ml Buffer A以及19.7ul的DTT(终浓度为0.5mM/L)及0.3ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，4℃静置过夜。 Tips 透析第一天更换TE buffer次数稍多一些，换5次 左右，后两天的次数可减少，早中晚各一次。 使用前沸水煮5min即可，冷却后装样，加样时要  带手套，防止手上油脂堵塞透析袋的孔，影响透  析效果。用时要检查是否会有液体的漏出，使用 后的透析袋应浸泡在20%的酒精中。 若蛋白浓度太高，在透析的过程中会有蛋白的析 出，建议在加入透析袋之前做等量体积的稀释。 透析之后的蛋白分装到EP管中，既