微孔板检测技术原理和应用课件.ppt

偏振中数据处理问题 G值 仪器分别测量与激发光偏振平面平行和垂直的偏振光时，使用相同但是不是同一个光学元件 校准，使用已知偏振值的荧光物质及其相应的缓冲液计算G值。 P实际＝G×P测量 G＝((RFU－BUF )×(1＋Pref))/((RFU－BUF )×(1＋Pref)) 偏振中数据处理问题 只有当被测样品的信号变化比对照组（正μC+、负μC- ）有足够的标准偏差，结果才有意义。 偏振中数据处理问题 荧光偏振优势 均相 (无分离/洗涤） 在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单 测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度/强度无关 无破坏性 (可重复测量) 无放射性 可实现高通量 荧光偏振缺点 FP使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein, TAMRA) ，它被限定为： 荧光标记的小的配体（如抗原）和大的受体（如抗体）的结合。 检测依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变。 以荧光为基础的检测技术 荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 荧光寿命(FLT) 荧光共振能量转移（FRET） FRET：一对合适的荧光物质，前者的发射波长正好是后者的激发波长，当二者达到一定的分子距离时（1～9nm），供体发出的光子能量会传递给受体分子，受体被激发，发射荧光 供受体的激发光谱要分得足够开 供体的发射光谱要与受体的激发光谱重叠 供受体的发射光谱要分得足够开 荧光共振能量转移（FRET） 荧光能量传递的效率与分子间的作用距离相关因此能量传递的发生及强度可以作为分子间发生相互作用以及相互作用强弱的指示特征 FRET的应用 分子间相互作用 药筛模型 蛋白质与核酸的结构和构象研究/蛋白质复合物的分配与组装 测量DNA寡聚体的结合（溶液中DNA杂交的动力学测量） 膜融合研究 分子内和分子间的距离测量 标记的大分子上特定位点的距离 测定供体和受体的距离，受体/配基相互作用 激酶反应检测 FRET荧光素对标记底物分子 位点特异性的酶不能切开被激酶磷酸化的底物，保持FRET；磷酸化的底物失去FRET 测量Donor的发射光（445nm）和Acceptor的发射光（520nm），计算比值445/520。比值越大，激酶活性越强 FRET的优势 均相检测 (无分离和洗涤步骤) 在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单 可以很好地观察活细胞内酶活性变化，并且能做到定时、定量、定位， 是一种非常有效的研究手段 无放射性 FRET的缺点 供体与受体的距离限定为10-80?，而许多生物结构（如蛋白-DNA复合物，大的蛋白，膜等）为80-130? 信噪比经常不佳，通常为1：1；背景噪声来自供体荧光干扰及受体被直接激发 供体与受体浓度的比率很关键 必须有两种荧光标记 以荧光为基础的检测技术 荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 荧光寿命(FLT) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 结合TRF与FRET，选择发光时间长的稀土元素作为Donor，使得Acceptor的发光时间更长 选择检测时间，避开激发光和Acceptor直接被激发的发光时间区域 解决信噪比问题 应用实例：cAMP浓度检测 cAMP重要的第二信使 传统的报告基因方法 HTRF 供体: 抗cAMP抗体用铕螯合物Eu(K)标记 受体: cAMP用XL665(Allophycocyanin)标记 样品分子: 处理后的细胞裂解物 cAMP与标记的cAMP竞争结合抗体 计算受体发射光与供体发射光的比值，比值越大则细胞中cAMP的浓度越低 应用实例：cAMP浓度检测 Y energy transfer XL665 Eu Excitation at 320nm Emission at 665nm ? long-lived decay at 665nm Time Intensity cAMP 由于Eu元素的荧光寿命较长，当FRET效应存在时，会使得XL665也保持较长的能量衰减时间 Energy Transfer from Eu to XL665 应用实例：cAMP浓度检测 cAMP Excitation at 320nm Emission at 665nm ? short-lived signal at 665nm, discriminated by timing parameters Time Intensity XL665 如果不存在FRET效应，激发光直接激发APC，APC所发出的是一个短寿命的荧光 No Energy Transfer 应用实例