桂花C4H基因的克隆与表达特性分析.pdfVIP

园艺学报，2016 ，43 (3) ：525 –537. Acta Horticulturae Sinica doi ：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0625；http ：//www. ahs. ac. cn 525 桂花 C4H 基因的克隆与表达特性分析 曾祥玲，郑日如，罗 靖，王彩云* （华中农业大学，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070 ） 摘 要：利用转录组测序获得的表达序列信息，结合 RACE 技术，从桂花（Osmanthus fragrans ）花 瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第 2 步反应的肉桂酸–4 –羟基化酶（C4H ）基因。其 ORF 全长分别为 1518 bp 和 1611 bp，各自编码 505 和 536 个氨基酸，命名为 OfC4H1 和 OfC4H2（登录号分别为KR861466 、 KF254842 ）。系统进化树表明，OfC4H1 与矮牵牛中的 PhC4H1、PhC4H2 等 C4H 蛋白聚为一类，属于 Class Ⅰ类型；OfC4H2 与金银花中的LjC4H 等属于 Class Ⅱ类型。进一步的 C4H 蛋白序列多重比较发现，OfC4H1 和 OfC4H2 蛋白具有该基因家族特有的保守结构域，在这些保守结构域中存在区别两类 C4H 蛋白的典型 特征。利用 Real-time PCR 比较分析了 OfC4H1 和 OfC4H2 基因的时空表达模式，结果显示，OfC4H1 在 花瓣中的表达量最高；OfC4H2 在花瓣中的表达量较低，在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建 原核表达载体 pET6xHN-C4Hs ，转化 Transetta （DE3 ）大肠杆菌并诱导表达的结果表明，目的蛋白能在原 核表达系统中顺利表达，而且与预期大小一致，但因溶解度较低无法进行酶活性分析。 关键词：桂花；肉桂酸 4 –羟基化酶；黄酮类化合物；原核表达；基因表达 中图分类号：S 685.13 文献标志码：A 文章编号：0513-353X （2016 ）03-0525-13 Cloning and Characterization of Cinnamate 4-hydroxylase （C4H ）Genes from Osmanthus fragrans * ZENG Xiang-ling ，ZHENG Ri-ru ，LUO Jing ，and WANG Cai-yun （Key Laboratory for Biology of Horticultural Plants ，Ministry of Education ，Huazhong Agricultural University ，Wuhan 430070 ，China ） Abstract ：According to the expressed sequence tags from transcriptome assembly and RACE method ，two cinnamate 4-hydroxylase genes ，which are the second key enzymes involving in phenylpropanoid biosynthesis ，were obtained from petals of Osmanthus fragrans. The ORF of these two C4H genes were separately 1 518 bp and 1 611 bp，encoded 505 and 536 amino acids and named OfC4H1 （GenBank No. KR861466 ）and OfC4H2 （GenBank No. KF254842 ）. Phylogenetic analysis showed that OfC4H1 protein was clustered together with Petunia hybrida C4H1