利用实时荧光定量pcr筛选新蚜虫疠霉内参基因referencegene.pdfVIP

Online system: 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2014, 22(12): 1575~1583 DOI: 10.3969/j.issn. 1674-7968.2014.12.013 利用实时荧光定量PCR 筛选新蚜虫疠霉内参基因 1 1 2 1* 薛承美 解廷娜 叶素丹 陈春 1 中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫重点实验室，杭州310018 ；2 浙江经贸职业技术学院，杭州310018 *通讯作者，aspring@ 摘 要 内参基因的准确选择是利用实时荧光定量PCR 进行准确分析基因相对表达量的前提。虫霉目 真菌新蚜虫疠霉(Pandoraneoaphidis)是重要蚜科专化性病原真菌，经常引发多种作物上蚜虫种群的流行 病。本研究通过实时荧光定量PCR 分析了新蚜虫疠霉ARSEF 5403 中3 个传统管家基因18SrRNA (18S)、28SrRNA(28S)和延伸因子1α相似蛋白(elongation factor-1 alpha-like protein, EF1) mRNA 表达差异 情况，并利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 软件综合分析了其在4 个生长阶段(分生孢子、萌发管时 期、短菌丝和长菌丝)和3 种营养条件(GLEN 培养基、OS-SDB 培养基和Grace 培养基)下表达的稳定性。 结果表明，基于公共数据库序列设计的候选内参基因的引物具有良好的扩增效率和特异性。经geNorm 软件分析，新蚜虫疠霉在不同生长阶段和不同营养条件下3 个候选内参基因的平均表达稳定性(M值)分 别为：18S 28S EF1(0.749)和18S 28S EF1(0.607) 。利用NormFinder 软 (0.457) ＞ (0.534) ＞ (0.389) ＞ (0.557) ＞ 件分析，新蚜虫疠霉不同生长阶段和不同营养条件下3 个候选内参基因的平均M值分别为：18S(0.084) ＞ 28S EF1(0.509)和18S 28S EF1(0.403) 。而BestKeeper 软件分析得到的稳定性 (0.264) ＞ (0.118) ＞ (0.355) ＞ 等级有所差异，在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因28S 表达最稳定，18S EF1最不稳 次之， 定。综合分析3 款软件对荧光定量PCR 结果的稳定性等级的平均值，得出在不同生长阶段和不同营养条 件下候选内参基因18S 18S 表达最为稳定。筛选出的 可作为分析新蚜虫疠霉基因表达差异的一个较为 可靠的内参基因，同时为后续研究新蚜虫疠霉的生长、毒力相关基因的表达分析研究提供技术支持。 关键词 新蚜虫疠霉，实时定量荧光PCR ，内参基因 Reference Gene Selection for Quantitative Real-time PCR in Pandora neoaphidis XUE Cheng-Mei1 XIE Ting-Na1 YE Su-Dan2 CHEN Chun1* 1 College of Life Science/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection Quarantine, China Jiliang University, Hangzhou 310018, Chi