人胰岛素样生长因子前体基因的重组表达及其蛋白纯化.pdfVIP

维普资讯 第 26卷第 9期 南京医科大学学报 (自然科学版) 2006年9月 ACTAUNIVERSITA兀SMEDICINAUSNANJING(NaturalScience1 ·825· 人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化 施有为，刘 莉，程蕴琳 (南京医科大学第一附属医院老年医学科，江苏 南京 210029) [摘 要] 目的：构建含有人胰岛素样生长 因子(humaninsulin—likegrowthfactor-1，hlGF一1)前体编码全长 cDNA的重组载体 ，使 其在 E．coliBL21(DE3)中表达 ，并对此表达菌株所表达 的重组蛋 白进行纯化 ，同时探讨其抗原性及应用价值 。方法 ：采用 PCR 法 ，扩增编码 hIGF一1前体 cDNA的片段 ，通过双酶切 、胶 回收纯化 、连接后得到 pET32a(+)／hlGF一1重组载体 ，然后将其转化入 BIJ21(DE3)中，经 IPrG诱导后表达 的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化 ，并用 Westernblot法检测重组蛋 白的抗原活性 。结果 ：重 组质粒 pET32a(+)h／IGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功 。BL21(DE3)表达 的重组蛋 白经 SDS—PAGE电泳后显示 ． 其表达量 占细菌总蛋 白量 的25％左右 ，该重组蛋 白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达 90％以上 。Western blot结果显示非常清 晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋 白具有免疫学特异性 。结论 ：pET32a(+)h／lGF一1重组载体构建成功，并能够高效表达 。 [关键词] 人胰 岛素样生长 因子．1；前体 PCR；重组蛋 白；亲和层析 [中图分类号] R587 [文献标识码] A [文章编号] 1007—4368(2006)09-0825．05 Construction．expressionandpurificationofrecombinanthumaninsulin—likegrowthfactor-1 precursor SHIYou-wei，LIULi，CHENG Yun-lin (DepartmentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospitalofNJMU，Nanjing210029，China) [Abstract] Objective：ToconstructarecombinantvectorcontainingthecDNAwhichencodeshumaninsulin．1ikegrowthfactor-1 precursorandtotransfectitinE．coliBL21(DE3)，thentopurifyrecombinantprotein，andtoinvestigatetheantigenicityandappli· cationoftherecombinantprotein．Methods：ByusingPCR technique，thetargetfragmentwhichcodedhumaninsulin—likergowth factor一1precursorcDNAwasamplified，andtheninsertedintotheexpressionvectorpET32a (+)．Subsequently，therecombinant vectorwastransformedintoBL21(DE3)．InducedbyIPTG，therecombinantproteinwaspurifiedwithNiaffinitychromatorgaphy．Its antigenicactivitywasassessedwithwestern blot．Results：Enzymedigestionanalysisandsequencingshowedthatthetargetfragment hadbeensuccessfullyinsertedintothevectorpET32a(+)．SDS—PAGEshowedthatBL21(DE3)expressionaccountedfor25％ ofall proteinthebact