原位杂交试验步骤质粒制备1质粒的转化和扩增1中国试剂网.pdfVIP

中国试剂网 3.18.1 原位杂交实验步骤 一、质粒制备 1 质粒的转化和扩增 1.1 制备XL1-Blue 感受态细菌 1． 取400uL XL1-Blue 菌种加入到含200ml LB 培养基的锥形瓶中，37 ℃、100 rpm 培养4h ，离心，倒置，以冰冷的0.1 mol ／L CaCl_2 重悬细菌，冰浴30 min， 离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2 重悬细菌，分装(200 μ ／tube) ，-80 ℃保存。 2 ． 转化：在冰浴中将1 管XL1-Blue 感受态菌解冻，将浓度为2ng ／μ1 的质粒 DNA4μ1 加入到8Oμ1 感受态菌中。 3 ． 轻轻摇匀，冰浴30 min 。 4 ． 42 ℃热激9O 秒，然后迅速冰浴2 min 。 5 ． 加入LB 培养液(无氨苄青霉素)0.8ml ，在37 ℃，100 转／min 水浴孵育 60 min 。 6 ．取200μl 菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg ／ml)-IPTG(200mg ／ml) 的 LB-氨苄青霉素50 mg ／ml,1μl ／ml 培养基) ，待菌液全部被吸收后，倒置平 板于37 ℃培养12-16h。 1.2 鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1． 用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml 含氨苄青霉素的LB 培养液的离心管 中，于37 ℃，200 转／分培养2h ，取1 ml 之一Eppendorf 离心管，加50μl 10mmol ／L EDTA(pH 8.0) 。 2 ． 加入50μl 新配置的0.2mol ／L NaOH 、0.5 ％SDS、20 ％蔗糖溶液后，振荡 3O 秒。 3 ． 在70 ℃温育5 min，然后冷却到室温。 4 ． 加1.5μ14mol ／L KCl 和0.5μ1 含0.4 ％溴酚兰染液，振荡3O 秒后，冰浴5 min 。 5 ． 12000g ，4 ℃离以 3 min ，以除去细菌碎片。 6 ． 制备1％的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg ／ml) ，取50μl 上清液加入到样品孔中， 其中一孔加入中等分子量DNA Marker 。恒压50V，进行电泳。 中国试剂网 3.18.1 7 ． 当溴酚兰迁移到凝胶全长的2 ／3-3 ／4 时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒 DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。 1.3 质粒的扩增和纯化 1． 用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg ／ml) 培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200 转／分培养3h 。 2 ． 将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml 锥形瓶中，37 ℃，200 转／分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。 3. 菌液中加入氯霉素液(34mg 溶于lml 乙醇，100ml 菌液加入0.5ml 氯霉素 溶液，终浓度为170 μ／ml) 。37 ℃，200 转／分培养12-16h。 4. 将培养的细菌倒入50ml 的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。 5. 弃净上清夜，用2ml 预冷的溶液I ，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min 6. 加入新配制的溶液 II 4ml ，快速用手晃动 10 秒，颠倒数次后，于室温静置 10 min。 7. 加入预冷的溶液III 3ml ，温和振荡l0 秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状 沉淀。 8． 6000rpm ，4 ℃离心15 min，保留上清。 9 ． 将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml 的离心管中，加入O.6 倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。(或-20 ℃4h ，或4 ℃过夜，可 便核酸沉淀) 10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残 兼上清液流尽。 11．于室温用70 ％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm 离心，15 min， 充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。 12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf 管中。 13．