小麦accasect功能域基因在大肠杆菌中的表达及与除草剂的相互作用.pdfVIP

Vol.32 高等 学校 化 学 学报 No.12 2011年12月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICALJOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES摇 摇 摇 摇 摇 摇 2817 ~2822 小麦ACCase CT功能域基因在大肠杆菌中的 表达及与除草剂的相互作用 1,2 1 1 1 1 1 王瑞俭 ,郑良玉 ,杨雪莹 ,杨摇 晔 ,王晓娟 ,曹淑桂 (1. 吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,长春 130012; 2. 北华大学林学院林业与生态环境实验室,吉林 132013) 摘要摇 以中国春小麦幼苗为材料,克隆构建了小麦质体乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的羧基转移酶(CT)重 组质粒(RCP18鄄5),并实现了重组质粒在大肠杆菌中的可溶性高表达. 对重组蛋白的性质研究表明,该蛋白 具有较强的疏水性,稳定性不高. 为改善这种状况,对CT功能域基因进行了截短和延长,同样于大肠杆菌 中进行表达. 结果表明,仅长度为2325 bp 的完整CT功能域基因能以可溶形式表达;2109 bp基因可表达, 但是以包涵体形式存在;而1869 bp及3501bp基因则不能表达. 通过圆二色光谱及差热扫描分析对纯化的 CT功能域蛋白与除草剂的相互作用进行研究表明,在除草剂存在下,CT蛋白的光谱发生显著变化,说明除 草剂与可溶性蛋白之间存在较强的相互作用. 关键词摇 乙酰辅酶A羧化酶;羧基转移酶功能域;蛋白表达;相互作用;除草剂 中图分类号摇 O629;Q786 摇 摇 摇 摇 文献标识码摇 A摇 摇 摇 摇 文章编号摇 0251鄄0790(2011)12鄄2817鄄06 乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl鄄CoA carboxylase,ACCase)在生物体中广泛存在,是控制脂肪酸代谢的 [1] 关键酶,也是近年来发现的可以开发手性抑制剂的重要靶标 . 植物中的ACCase 由一条多肽链构成 的3个功能域组成[2~6] ,分别为生物素羧化酶(Biotin carboxylase,BC)功能域、生物素羧基载体蛋白 (Biotin carboxyl carrier protein,BCCP)功能域及羧基转移酶(Carboxyltransferase,CT鄄茁 和CT鄄琢)功能域. [7] ACCase 的主要功能是催化乙酰辅酶A(Acetyl鄄CoA)羧化生成丙二酰辅酶A(Malonyl鄄CoA) ,反应包 括两步,分别由BC和CT功能域催化完成,而连接有生物素的BCCP功能域则在BC和CT功能域之间 传递羧基,这一过程是生物合成脂肪酸的限速步骤. 目前,禾本科植物的质体ACCase被发现是芳氧苯氧丙酸类(Aryloxyphenoxypropionate,APP)和环 己二酮类(Cyclohexanedione,CHD )两大类除草剂作用于植物的靶蛋白[8~10]. 动力学研究表明,这两 类除草剂作用的靶点是ACCase 的CT功能域[11~13] ,它们选择的基础是识别其结构,抑制其活性,使 脂肪酸生物合成受阻,造成禾本科植物死亡. 这两类除草剂可以选择性地杀死禾本科杂草,而对其它 作物无影响,因此作为高效低毒的除草剂在农业中广泛应用. 然而,随着这两类除草剂的长期大面积 使用,对其不敏感的禾本科杂草相继出现,如何克服禾本科植物的耐药性成为近年来的研究热点. 对 这一问题进行系统研究的前提是了解禾本科植物ACCase 的CT 功能域对除草剂的选择性识别机制和 抗性机制. 然而,对于机制的研究首先需要获得足量的高纯度实验材料———CT 功能域蛋白. 由于 ACCase在生物体内含量低,难以纯化且该酶稳定性不高,因此从组织、细胞中提取该酶作为研究材料 几乎是不可能的[14,15]. 通过体外表达获得重组蛋白是解决这一问题的有效途径[16~19]. 本文采用基因工程的方