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木聚糖酶活力的测定方法
木聚糖酶活力的测定方法
1.木聚糖酶活力单位定义
在37℃、pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。
2.测定原理
木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
3.试剂与溶液
除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:
吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解,定容至100ml。
3.2 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:
称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解,定容至100ml。
3.3 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:
称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解,定容至100ml。
3.4 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:
称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解,定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5。
3.5木糖溶液,c(C5H10O5)为10.0mg/ml:
称取无水木糖1.000g,加缓冲液(3.4)溶解,定容至100ml。
3.6 木聚糖溶液:1.0%(w/v)
称取木聚糖(Sigma X0672)1.00g,加入氢氧化钠0.34 g,磁力搅拌再加入60ml水,磁力搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5 ml,再用乙酸溶液(3.1)调节pH值至5.5。继续搅拌30min,用缓冲液(3.4)定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为7天。
3.7 DNS试剂
称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月。
4.仪器与设备
4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。
4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目)。
4.3 分析天平:感量0.001g。
4.4 pH计:精确至0.01。
4.5 磁力搅拌器:附加热功能。
4.6 电磁振荡器。
4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45 (m。
4.8 离心机:2000g以上。
4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃。
4.10 秒表:每小时误差不超过5s。
4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围。
5.标准曲线的绘制
吸取缓冲液(3.4)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样。
分别吸取木糖溶液(3.5)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.4)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml木糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(5.7)。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值。
以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
6.试样溶液的制备
固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm)。
称取试样两份,精确至0.001g。加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.4)。磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.4)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h。摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min。吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.4)做二次稀释(稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.08U/ml之间)。
液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.4)进行稀释、定容(稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制
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