拟南芥AtCAO和AtHEMA1基因共表达载体的构建及转烟草研究.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（４）：５４６０ 拟南芥ＡｔＣＡＯ和ＡｔＨＥＭＡ１基因共表达载体 的构建及转烟草研究 李翠萍　潘　宇　白小宁　褚福堂　苏承刚　张兴国 （西南大学园艺园林学院南方山地园艺学教育部重点实验室　重庆　４００７１５） 摘要　增加作物的叶绿素含量，尤其是叶绿素ｂ的含量，是增强作物耐弱光性的可能途径。将拟 南芥叶绿素合成的关键酶———谷氨酰ｔＲＮＡ还原酶（ｇｌｕｔａｍｙｌｔＲＮＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＨＥＭＡ１）的基因和 促进叶绿素ｂ合成的关键酶———叶绿素酸酯ａ加氧酶（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅａｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＣＡＯ）的基因， 构建于同一个植物双元表达载体，经农杆菌介导整合进烟草基因组。结果显示，弱光下转基因烟 草比野生烟草的叶绿素总量增加不显著，但叶绿素ｂ含量增加 １６％～１７％、叶绿素ａ／ｂ比值降低 ９％～１２％、光合作用增强４２％～６５％，均达到显著水平，而且生长发育比野生烟草快。为今后改 良作物的耐弱光性奠定了基础。 关键词　烟草　ＡｔＨＥＭＡ１基因　ＡｔＣＡＯ基因　叶绿素　耐弱光 中图分类号　Ｑ７８６ ［１３］ 　　弱光是作物设施栽培的主要障碍之一 。通过 催化叶绿素ａ氧化形成叶绿素ｂ，是叶绿素ｂ形成的唯 常规育种方法，可培育出耐弱光的新品种，但存在资源 一途径［１１１２］。 匮乏、改良困难和周期长等局限性，而转基因技术将是 　　本实验克隆了拟南芥 ＣＡＯ基因（ＡｔＣＡＯ），并与拟 改良作物耐弱光性的重要途径。 南芥ＡｔＨＥＭＡ１基因相连接，构建了含有双价目的基因 　　增强作物耐弱光性的一个策略是增加其光合色 的双元表达载体，经农杆菌介导整合进烟草基因组，分 素———叶绿素，尤其是叶绿素ｂ的含量。在叶绿素合 析这两个基因共表达对叶绿素总量、叶绿素ａ含量、叶 成途径中，５氨基乙酰丙酸（ＡＬＡ）是所有卟啉化合物的 绿素ｂ含量和光合性能等方面的影响，以期增强转基 ［４５］ 因烟草对弱光的捕获能力，提高其耐弱光性，为今后用 共同前体，与光合作用和呼吸作用相关 。提高植物 中的ＡＬＡ含量可提高叶绿素含量，进而增强耐弱光 于其它作物的耐弱光改良奠定基础。 ［６７］ 性 。由谷氨酸合成ＡＬＡ是叶绿素生物合成途径的 １　材料与方法 限速步骤，其中谷氨酰 ｔＲＮＡ还原酶（ｇｌｕｔａｍｙｌｔＲＮＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＨＥＭＡ１）是此途径的关键酶。拟南芥中有３ １．１　材　料 个基 因编码谷氨酰 ｔＲＮＡ还原酶，即 ＡｔＨＥＭＡ１、 １．１．１　植物材料　拟南芥（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＬ． ［８１０］ ＥｃｏｔｙｐｅＣｏｌｕｍｂｉａ）和烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ． ＡｔＨＥＭＡ２和ＡｔＨＥＭＡ３ 。其中，ＡｔＨＥＭＡ１受光诱导， 在光合组织中表达，而ＡｔＨＥＭＡ２、ＡｔＨＥＭＡ３主要在根中 Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ３８）由本实验室繁殖和保存。 表达。此外，许多阴生植物的叶绿素ｂ含量较高，叶绿 １．１．２　菌株、质粒　大肠杆菌菌株ＸＬｂｌｕｅ、农杆菌菌 １ 素ａ／ｂ比值较低，有利于吸收弱光环境中的散射光，而 株 ＥＨＡ１０５（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、双元载体 叶绿素酸酯ａ加氧酶（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅａｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＣＡＯ） ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２由实验室保存；含ＡｔＨＥＭＡ１基因的表达 ［１３］