猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因的融合表达及其多克隆-动物营养学报.PDFVIP

动物营养学报２０１４，２６（１１）：３３４９⁃３３５５ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ 　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１４．１１．０２２ 猪磷酸酪氨酸互作结构域 １基因的融合表达及其 多克隆抗体的制备和鉴定 ∗ 陈小玲　 王　 欢 　 黄志清　 周　 波　 贾　 刚　 刘光芒　 赵　 华 （四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，成都 ６１１１３０） 摘　 要： 本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域 １（ｐＰＩＤ１）重组蛋白，并制备 ＋ ＋ ｐＰＩＤ１ 多克隆抗体。 将ｐＰＩＤ１基因插入ｐＥＴ２８ａ（ ），构建重组ｐＥＴ２８ａ（ ）⁃ｐＰＩＤ１ 大肠杆菌表 ＋ 达质粒，然后将重组质粒ｐＥＴ２８ａ（ ）⁃ｐＰＩＤ１转化到大肠杆菌ＢＬ２１ 感受态细胞中，获得的重组 － － － 子以不同异丙基硫代 β Ｄ 半乳糖苷（ＩＰＴＧ）浓度、温度和时间诱导，确定ｐＰＩＤ１ 融合蛋白表达 ２＋ － 的最适条件。 将表达产物经镍离子 亚氨基二乙酸（Ｎｉ ⁃ＩＤＡ）亲和层析纯化后进行基质辅助激 光解析电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦ⁃ＭＳＭＳ）鉴定。 同时，将纯化获得的ｐＰＩＤ１ 融合蛋白免 疫ＳＤ 大鼠，制备ｐＰＩＤ１ 多克隆抗体，并检测抗体效价。 结果表明：ｐＰＩＤ１ 融合蛋白表达的最佳 条件为３０ ℃以０．１ ｍｍｏｌ／ Ｌ ＩＰＴＧ 诱导 ４ ｈ；纯化的融合蛋白经ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦ⁃ＭＳＭＳ 鉴定为 ｐＰＩＤ１；特异性的ｐＰＩＤ１ 多克隆抗体成功制备，抗体效价为１∶２０ ４８０。 本试验成功制备了高纯度 的重组ｐＰＩＤ１及其多克隆抗体。 关键词： 猪ＰＩＤ１；原核表达；纯化；质谱鉴定；多克隆抗体 中图分类号：Ｓ８２８　 　 　 　 文献标识码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１４）１１⁃３３４９⁃０７ 　 　 磷酸酪氨酸互作结构域 １（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｉｎ⁃ ３Ｔ３⁃Ｌ１脂肪前体细胞的增殖和脂肪细胞数目的增 － ｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １，ＰＩＤ１）基因是 Ｗａｎｇ ［１ ２］ 多 ，而脂肪细胞过度增殖是脂肪沉积发生的重 ［１］ ［６］ 等 于２００６年采用抑制性消减杂交技术筛选肥 要环节 。 前人对 ＰＩＤ１基因的研究主要以人和 胖与正常人腹膜脂肪组织后而获得的新基因。 该 鼠为对象，对猪ＰＩＤ１基因的研究较少。 钱源等［７］ 基因最先命名为ＮＹＧＧＦ４ 基因，后根据该基因的 首次采用简并引物克隆到猪 ＰＩＤ１基因的编码序 结构特征被国际统一命名为ＰＩＤ１基因。 基于生 列（ＣＤＳ），蛋白结构域分析发现该序列 Ｃ 端也含 物信息学分析，发现ＰＩＤ１蛋白序列中存在磷酸酪 有一ＰＴＢ结构域，与 ＩＲＳ１ 中ＰＴＢ 结构域的结构 氨酸作用位点（ＰＴＢ），该位点与胰岛素受体底物－ ［７］