第三章-酶的分离与纯化.pptVIP

Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 酶的分离纯化 Contents of chapter 3 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 3.4 酶的分离方法 （2）等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1）原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 2）使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相 距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析 法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定 的溶解度。 3）优点： a.大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内 b.无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 4）缺点： 酸化时，容易引起蛋白质失活 （3）有机溶剂沉淀（降低介电常数） 　利用酶蛋白在有机溶剂中的溶解度不同而使 　　之分离的方法。 1）沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2）常用有机溶剂 　丙酮?乙醇?甲醇，用量一般为酶液体积的2倍 　左右，终浓度为70%。 3）优缺点： 优点：a. 分辨率比盐析法高 b. 沉淀不需脱盐，溶剂易蒸发 c. 沉淀易离心 缺点：a.容易引起蛋白质变性失活 b.有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 4、层析法 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 层析法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相 层析法的分类 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析 按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 2）吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 ①吸附剂的选择： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭 1） 基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。 ③加样 体积不能过多，不超过床体积的5％，脱盐时可在10％左右。 ④洗脱 洗脱液与平衡时用的buffer一致。 洗速不可过快，保持恒速。 ⑤胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。 用0.02%NaN3防腐。 （3）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 1)原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。 （5）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。