大型海藻龙须菜蛋白提取及双向电泳体系的优化.pdfVIP

2013年 11月 汕头大学学报 (自然科学版) 第28卷 第4期 Nov．2Ol3 JournalofShantouUniversity(NaturalScience) V01．28 NO．4 文章编号：1001。4217(2013)04—0034—07 大型海藻龙须菜蛋 白提取及双向电泳体系的优化 王会芳，颜海波，杜 虹 (汕头大学生物系，广东 汕头 515063) 摘 要：本文以龙须菜为材料，比较了尿素／硫脲法，改 良丙酮沉淀法，Trizol法 3种不同蛋 白质提取方法；并从胶条长度及pH范围，上样量，分离胶浓度等因素探讨了双向电泳技术 体系的优化．结果表明：采用Trizol法辅以超声破碎提取龙须菜总蛋白效果优于尿素／硫脲法 和改良丙酮沉淀法；同时，采用pH4—7，11am胶条，上样量为800Ixg，分离胶浓度为 12％ 的双向电泳条件可获得背景清晰，分辨率好的二维电泳图谱．该体系也可以为龙须菜属和江 蓠属其他海藻的蛋白质双向电泳分析提供参考． 关键词：龙须菜；蛋 白提取；双向电泳 中图分类号：Q503 文献标识码：A 0 引 言 龙须菜(Gracilarialemaneiformis)隶属红藻(Rhodophyta)，是龙须菜属中重要的大型 海藻．龙须菜所产的琼胶含量高，品质好 】，同时还具有生长快、能适应较高温度等特 点，因此在南方被大面积养殖．此外，龙须菜可以作为氮(N)、磷(P)等营养元素的生物 过滤器，对净化海水和防止赤潮发生起到重要作用 ，因此成为修复富营养化海水的研究 热点 ．在栽培过程中，营养盐，温度等外界环境条件的变化会影响龙须菜的生长 ， 所以开展龙须菜抗逆机制的研究有重要意义．目前已在基因水平开展了有关龙须菜抗逆 机制的研究工作 ，如顾颖慧 探讨了高温胁迫下热激蛋 白hsp70的响应 ，证实了hsp70 在耐高温龙须菜品系中有更高的表达量，而在蛋 白质水平的有关研究很少．因此开展逆 境胁迫下龙须菜差异蛋白质组学的研究对龙须菜生理及抗逆机制研究有重要意义．双向 电泳技术是蛋 白质组学研究的核心技术，但适合龙须菜蛋白质组学的双向电泳体系还未 建立． 文章从龙须菜蛋白抽提方法，双向电泳胶条长度和pH范围，上样量，分离胶浓度 等方面进行了探讨，为龙须菜逆境蛋白质组学水平的研究奠定基础，同时为龙须菜属和 江蓠属其他大型海藻蛋 白质组学研究提供参考． 收稿 日期：2013—03—17 作者简介：卡十虹(1976一)，女，汉族，广东省澄海市人，教授．E—mail：hdu@stu．edu．cn 基金项 目：国家自然科学基金资助项 目；国家海洋局海洋公益性行业专项资助项 目(201105008—9) 第4期 王会芳等：大型海藻龙须菜蛋白提取及双向电泳体系的优化 35 1 材料与方法 1．1 材料预培养 龙须菜由汕头大学南澳实验站提供．于20±1℃和2000lx光强 (光周期为 12h：12 h)的条件下用过滤海水(盐度为 30％、pH8．0)，预培养一周，挑选色泽紫红、枝芽完整、 健康匀称的龙须菜藻体备用． 1．2 蛋 白样品提取 取龙须菜嫩茎部分适量，加入液氮研磨成粉状，置一8O℃备用．采用如下三种方法 提取蛋 白： 尿素／硫脲法 提取蛋 白：取 1．5g上述龙须菜粉末，加入 1．5mL尿素／硫脲裂解液， 常规超声破碎 ，于 4oC，12000g，离心 15min，取上清，置一20℃备用． 改 良丙酮沉淀法 提取蛋 白：将 2．5mL预冷的丙酮加入 500 L含蛋 白提取物的尿 素／硫脲裂解液中，一20℃过夜沉淀蛋 白，预冷丙酮清洗 2次，室温下晾干，加入 500IxL 裂解缓冲液重新溶解蛋白． Trizol[7】提取蛋 白：向1．5g龙须菜粉末中加入 3mLTrizol，振荡 1rain，5s／5s超声 破碎 5rain，加入600txL氯仿，振荡 15s，室温下放置 5min，4cc，12000g，离心 15 min，去除上层 白色液体，加人 1mL乙醇，4℃，2000g，离心5rain，取上清，加入6 mL异丙醇，室温静