上海交通大学-PCR仪与冻干机.pptVIP

冻干箱是一个能够致冷到-40℃左右，能够加热到+50℃左右的高低温箱，也是一个能抽成真空的密闭容器。它是冻干机的主要部分，需要冻干的产品就放在箱内分层的金属板层上，对产品进行冷冻，并在真空下加温，使产品内的水份升华而干燥。 冷凝器同样是一个真空密闭容器，在它的内部有一个较大表面积的金属吸附面，吸附面的温度能降到-40℃以下，并且能恒定地维持这个低温。冷凝器的功用是把冻干箱内产品升华出来的水蒸气冻结吸附在其金属表面上。 冻干箱、冷凝器、真空管道和阀门，再加上真空泵，便构成冻干机的真空系统。真空系统要求没有漏气现象，真空泵是真空系统建立真空的重要部件。真空系统对于产品的迅速升华干燥是必不可少的。 致冷系统由冷冻机与冻干箱、冷凝器内部的管道等组成。冷冻机可以是互相独立的二套，也可以合用一套。冷冻机的功用是对冻干箱和冷凝器进行致冷，以产生和维持它们工作时所需要的低温，它有直接致冷和间接致冷二种方式。 加热系统对于不同的冻干机有不同的加热方式。有的是利用直接电加热法；有的则利用中间介质来进行加热，由一台泵使中间介质不断循环。加热系统的作用是对冻干箱内的产品进行加热，以使产品内的水份不断升华，并达到规定的残余水份要求。 控制系统由各种控制开关，指示调节仪表及一些自动装置等组成，它可以较为简单，也可以很复杂。一般自动化程度较高的冻干机则控制系统较为复杂。控制系统的功用是对冻干机进行手动或自动控制，操纵机器正常运转，以冻干出合乎要求的产品来。 如感兴趣可自学 冷冻干燥机 药学院公共实验室 冻干机操作规程 1、样品预冻 水溶液，不能含有机溶剂（因为里面是橡胶件）。 样品厚度不超过1 cm，否则冻不透。 -70～-80℃冰箱4小时。 样品瓶用滤纸或封口膜封口，并用针戳洞。 ***预冻是冷冻干燥之前必经的一步。产品在进行冷冻干燥时，需要装入适宜的容器，然后进行预先冻结，才能进行升华干燥。预冻过程不仅是为了保护物质的主要性能不变；而且要获得冻结后产品有合理的结构以利于水份的升华；注意容器的选择，以便日后的应用。 2、开机 关闭排液阀； 关闭外挂放气口，手枪柄朝上； 开真空泵，预热15 min； 开冷阱到-45℃； 取样品，盖上有机玻璃盖，双手按压旋转至密封（此时显示器显示真空度A），注意放样品前需查验是否已用少量真空硅脂均匀涂抹密封面。 ① 关闭排液阀 ②关闭外挂放气口，手枪柄朝上； ③开真空泵，预热15 min ④ 开冷阱，等温度降至-45℃ 样品放置好之后的冷冻干燥台 ⑤ 盖上有机玻璃盖，双手按压旋转至密封 放样品前需查验是否已用少量真空硅脂均匀涂抹密封面 有机玻璃盖密封后，显示器最初显示真空度A，开始抽真空时，假如的确密封，则显示大气压800 mbar；随着抽真空的进行，大气压逐渐降低，降至1以下。显示器显示温度最低可达-62℃左右，真空度最大可达0.06m bar。 3、关机 先缓慢放气——外挂口手枪柄至45℃左右； 放气真空度稍有下来，即可关闭真空泵，缓慢放气； 关冷阱； 开排液阀。 谢谢！ Taq酶 来自水生嗜热菌Thermus aquaticus YT-1，该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到。生长在70～75℃极富矿物质的环境中。 Taq聚合酶的特点及浓度： 具有良好的热稳定性。在70～75℃时生物学活性最高；92.5℃时半衰期为130 min。 具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性，因此没有校正功能，使用Taq酶的PCR反应出现错配的几率为2.1×10-4左右。 是Mg2+依赖性酶，其活性对Mg2+很敏感。 在100μl反应体系中所需Taq聚合酶的量为0.5～5U。若浓度过高，可引起非特异性产物扩增；浓度过低则合成产物量减少。 PCR反应体系缓冲液（Buffer）的成分 KCl在50 mmol/L时能促进引物退火，大于此浓度则抑制Taq酶的活性，高于75 mmol/L时PCR反应明显抑制。 Tris-Cl主要用于调节pH值，使得Taq酶的作用环境维持偏碱性。一般用量为10～50 mmol/L。 Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。1.5～2.0 mmol/L Mg2+较合适；过多会增加非特异性扩增并影响产率。 牛血清白蛋白BSA（或明胶）对酶具有保护作用，但用量需要限制；而且BSA的质量会影响其作用。 缓冲液中的如果反应体系中加入适量二甲亚砜（DMSO）可减少模板二级结构，提高PCR反应特异性，但对聚合酶活性有一定影响。 引物 PCR反应中的引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L。 引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，可增加引物之间形成二聚体的几率；非特异性产物和引物二聚体可竞争使用酶、dNTPs和引物本身，使正宗PCR产物产率下降。 dNTPs dNTP