分子生物学RTPCR.pptVIP

第二部分 RT-PCR的原理，方法及琼脂糖凝胶电泳结果分析 RT-PCR技术背景 （1）基因的表达 （2）PCR技术 变性 退火   延伸 （3）逆转录酶和RT-PCR RT-PCR技术目的 通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度 RT-PCR实验原理 m-RNA c-DNA PCR产物 RT(反转录) PCR 这里修改标题 RT-PCR实验原理 RT-PCR实验步骤——提取总RNA TRIzol法抽提总RNA 1、细胞1×107 或组织100mg,加1mlTRIzol (细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管）  颠倒混匀10下，室温5分钟。 2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。 3、4℃，离心12000g，15分钟。 4、转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。 5、4℃，离心12000g，10分钟。 6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。 7、4℃离心7500g，5分钟。 8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20μl（可在55-60℃水中，10分钟助溶）。 9、紫外分光光度计测总RNA浓度。 RT-PCR实验步骤——反转录（RT） 逆转录反应： 1、RNA 1-5μg,加入适量的DEPC水至11μlOligo(dT)15 1μl混匀，离心，70℃ 10min。 2、立即冰水浴。 10X PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl 10mM dNTPmix 1μl 0.1M DTT 2μL 混匀，离心，42℃ 50min。 3、95℃ 10min（破坏MLV,终止反应），4℃保存。  RT-PCR实验步骤——聚合酶链反应(PCR) PCR反应： 反应体系：总体积20μl(50μl)  试剂 浓度 体积 Taq Buffer 10× (5μl_) dNTP 10mM (0.5μl) 上游引物 10pmol/μl (1μl) 下游引物 10pmol/μl (1μl) cDNA模板 (1-10μl) Taq酶 2.5U/μl (1μl) DEPC水 20μl-4.3μl 混匀  28-36循环，4℃保温  RT-PCR实验步骤——琼脂糖凝胶电泳 加1-10μl PCR产物与上样缓冲液（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。 成像系统进行成像分析。 琼脂糖凝胶电泳结果分析 DNA分子中含有磷酸基和碱基，在生理条件下，磷酸基中的羟基发生解离，因此DNA带负电在电场中向正极移动。 数量分析：条带的宽度、荧光的亮度 质量分析：纯度，分子量 琼脂糖凝胶电泳结果分析