精子上游器研制和其实验效果.docVIP

精子上游器研制和其实验效果 　　【摘要】目的：研制一种新型精子优选器皿―精子上游器（发明专利号：ZL 20081），并检测其实验效果。方法：采用精液样本30份，每份精液样本平分为两份，分别用精子上游器（实验组）和传统的四试管上游法（对照组）上游处理，然后分析处理后精子的浓度和活力及前向运动精子数。结果：实验组精液a级、前向运动精子率和前向运动精子数均高于对照组，差异有统计学意义（P值均 　　1.2设备和材料 1.2.1实验仪器精液分析仪：北京清华同方股份有限公司；离心机：北京白洋离心机有限责任公司；生物显微镜：Olympus CX21；CO2培养箱：FH90香港力康生物医疗科技控股有限公司；百级超净工作台：苏州佳宝净化工程设备有限公司；移液管：美国BD Falcon公司；试管：美国BD Falcon 公司；离心管： 美国BD Falcon公司。 1.2.2试剂EARLEs平衡盐溶液：美国Sigma-Aldrich公司；代血清（SSS）：美国 Irvin Scientific公司。 1.3精液收集 30份精液样本取自到山东大学附属济南市中心医院生殖医学科做精子质量检测的男性。男性年龄24～40岁，平均（30.57±3.36）岁。根据《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验手册（第四版）》[6]，取精前均禁欲2～7d。所有精液通过手淫方式全部收集在一洁净的60mL广口样品杯内。此样品杯已通过精子毒性检测，在实验室被广泛应用。精液分析之前液化至少30min。精液收集到精液检测开始的时间间隔不超过60min。精液量≥2mL；精子浓度≥20×106/mL；a+b级（前向运动）精子≥20%。符合本实验精液入选标准。 1.4精液分析 应用精液分析系统常规对精液样本分析后，按体积将精液平分为两份，分别进入实验组与对照组进行处理。 1.5上游液的制备 精子上游液（含10%代血清（SSS）的Earles平衡盐溶液）：9mL earls液+1mL SSS，置37℃、5%CO2浓度的培养箱中过夜平衡。 1.6方法 1.6.1实验组取精子上游器1个，旋转上层带孔小瓶，使两个带孔小瓶的瓶底小孔重合，从而使小孔打开，再从带孔小瓶的瓶底外周最大小孔中用一次性洁净移液管加入预热到37℃左右的上游液8mL，再从小孔中用移液管小心缓慢地将其中一份精液加入到上游液底部，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中30min。取一次性洁净离心管1支，贴标签并注明编号。旋转上层带孔小瓶30度，使带孔小瓶底部变为盲面，将上层悬液倒入离心管，200g离心10分钟。缓慢吸出上清液，留沉淀物，加上游液至0.5mL，制成精子悬液。检测、记录悬液的精子浓度、前向运动精子率和前向运动精子数。 1.6.2对照组应用4个一次性洁净试管，在每个试管中加入已预热好的上游液2mL，用移液管将每份精液标本1/4量分别缓慢加入到每个试管的底部。置试管架上45°倾斜，37℃、5% CO2培养箱中放置30min。取离心管1支，贴标签并注明编号。收集各试管上层精子悬液， 放入离心管，200g离心10min。缓慢吸出上清液，留沉淀物，加上游液至0.5mL，制成精子悬液。检测、记录悬液的精子浓度、前向运动精子率和前向运动精子数。 2统计学处理 采用PASW 18.0（2010）统计分析软件进行统计学分析，检测数据用±s表示，精子浓度与活力数据比较采用双侧配对设计t检验，P 　　各界专家学者已经发明了多种优选精液的设备，如王福楠博士发明的王氏管法[17，18]，其处理精液效果较好，可以明显提高精液的活力，消除精液中的病原微生物，但其设计复杂，所用试管成本较高，且不能重复利用，使其临床应用与推广受到了很大的限制。而本精子上游器构造简单，成本与传统的多试管上游法相当，易于临床应用与推广。 参考文献 [1]Grunewald S， Said TM， Paasch U， et al. Relationship between sperm apoptosis signalling and oocyte penetration capacity. Int J Androl， 2008（31）：325-330. [2]Brugnon F， Ouchchane L， Pons-Rejraji H， et al. Density gradient centrifugation prior to cryopreservation and hypotaurine supplementation improve post-thaw quality of sperm from infertile men with oli