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霍乱的实验室检测 长春市疾病预防控制中心 霍乱弧菌的分离与鉴定 一 霍乱实验室诊断的相关实验技术 二 霍乱的实验室检测 霍乱弧菌的分离与鉴定 1、样本的采集 2、样本的送检 3、分离培养 4、菌株鉴定 霍乱弧菌的分离与鉴定 1、样本的采集 患者的粪便、呕吐物、肛拭子为必须标本。 水样便或呕吐物采样量一般为1mL-3mL，成型便采取指甲大小的粪量；肛拭子可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm-5cm处旋转后取出。  霍乱弧菌的分离与鉴定 2、样本的送检 采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种的，应放入PH值8.8-9.0碱性蛋白胨水或文腊二氏保存液或插入Carry-Blair半固体保存培养基中送检。 标本与保存液的比例约为1:5。 病人标本含有大量病菌，标本装入试管或小瓶时，注意勿污染容器口外壁，必须妥善包装，运送中注意安全。  霍乱弧菌的分离与鉴定 3、分离培养 増菌后的分离培养： 所有标本均应接种碱性蛋白胨水培养基，37℃増菌6h-8h。 从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强、弱选择培养基各一个，37℃培养18h-24h。 必要时进行二次増菌。 霍乱弧菌的分离与鉴定 3、分离培养 直接分离培养： 对急性期患者水样便标本，在进行増菌培养的同时可取一接种环或用肛拭子直接接种在选择性培养基上，37℃培养18h-24h。  霍乱弧菌的分离与鉴定 3、分离培养 强选择性培养基：庆大霉素琼脂，TCBS琼脂和四号琼脂等 弱选择性培养基：碱性营养琼脂  霍乱弧菌的分离与鉴定 3、分离培养 不同选择培养基上生长的霍乱弧菌典型菌落特征： 碱性营养琼脂：较大，无色，圆形，透明或半透明、表面光滑、湿润、扁平或稍凸起、边缘整齐，水滴状，菌落直径一般约为2mm 庆大霉素琼脂和四号琼脂：透明性略差，多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深 TCBS琼脂：黄色发亮，表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐 霍乱弧菌的分离与鉴定 3、分离培养 霍乱弧菌在TCBS琼脂平板上的菌落特征（18h-24h） 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 4.1 染色 O1群霍乱弧菌为革兰阴性、弯曲呈弧状，无芽孢，无荚膜，菌体两端钝圆或稍平，单端鞭毛； O139群霍乱弧菌的形态及运动与O1群霍乱弧菌近似，但是O139群霍乱弧菌菌体周围有一层比较薄的荚膜。 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 霍乱弧菌纯培养的镜下形态（革兰染色） 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 4.2 玻片凝集试验 取纯培养物与O1群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或O1群多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或诊断血清做玻片凝集试验。 剩余菌落亦可用来做单价血清的玻片凝集，以确定血清型。 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 4.2 玻片凝集试验 生长在TCBS上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难于乳化，不能直接进行玻片凝集试验。 要注意同一标本存在O1群和O139群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每份标本至少挑选5个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 4.3 氧化酶试验 试剂：1%盐酸对氨基二甲苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液 试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加上述试剂，如培养物在1-2min内出现粉红-紫红-紫蓝色，有的最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 4.4 菌株复核 经初筛阳性或可疑阳性的菌株，应尽快送当地疾病预防控制中心进行复核鉴定。 复核结果符合O1群或O139群霍乱弧菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或省级以上CDC进行确认分析。 霍乱弧菌的分离与鉴定 4、菌株鉴定 4.4 菌株复核 菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、动力试验。 生化反应： 葡萄糖（+）、麦芽糖（+）、 阿拉伯胶糖（-）、氧化酶（+）、 DNA酶（+）、霍乱红（+） 霍乱实验室诊断的相关实验技术 1、霍乱弧菌基因PCR检测 霍乱毒素是霍乱弧菌主要的致病因子，在霍乱诊断上霍乱毒素基因（ctxAB）的PCR检测具有重要的诊断价值。 特异性和灵敏度均较高， 需符合PCR试验条件的实验室， 需要严格的核酸提取操作， 直接检测是否为产毒株。 霍乱实验室诊断的相关实验技术 2、霍乱弧菌快速辅助检测 霍乱弧菌胶体金快速检测法 主要针对检测O1群和O139群霍乱弧菌抗原成分，操作简