第05章 纸层析.pptxVIP

第二部分 分离技术;第5章 纸层析Paper Chromatography;5.1、纸层析简介;5.2、基本原理;如果有多种物质存在于固定相和流动相之间，它们将随着流动相的移动在固定相与流动相之间进行连续地、动态地不断分配，由于各种物质分配系数的差异，其移动速度不同。 分配系数大的组分在纸上迁移速度慢； 分配系数小的组分迁移速度快。 ;;5.3 实验操作技术;一、滤纸的选择;二、溶剂的选择;三、样品的预处理;四、点样;加样量的多少由分离的样品、展层方式和检出方法来决定，对于单向上行和下行层析来说，点样体积在2一20μl之间，样品量在10-30 μg之间即可得到好的层析图。 样品一般点成圆形或条状。直径不要超过0.5 cm。 ;五、饱和与展层;双向纸层析是层析法的一个改进，层析时样品点在左下角，用溶剂A进行第一向展开。 从洛剂中取出层析图谱后使之干燥，然后旋转90度再用溶剂B进行第二向展层。 此方法己应用于研究酶的专一性，即在两次展开之间把酶溶液喷淋到层析图谱上，然后观察该酶对第一次分离的化合物作用。 ;展层时要防止滤纸与滤纸、滤纸与容器壁贴在一起以及滤纸的歪斜与弯曲。 为防止操作中对滤纸的污染，尽量避免用手直接接触滤纸，最好带手套或指套。 展层时间根据温度和纸的大小、性质而定，一般是待溶剂前沿距离滤纸另一端1 cm处停止。 ;六、图谱显示;微生物法 是基于对某些微生物的生长抑制作用来决定是否存在有关化合物的一种检出方法。 方法:将展层后的滤纸烘千，平贴在接种有某种试验菌的琼脂平板的表面，37℃保温15-20小时后，在有抗菌素扩散进琼脂平板的部位，即明显可见无微生物的抑菌圈。 根据抑菌圈的直径大小与抗菌素浓度的关系可半定量检出抗菌素含量。 ;同位素和放射自显影方法 层析分离后，纸上的色谱点可用放射性试剂处理，使其形成一种具有放射性的衍生物，然后再用放射自显影方法将它们定位。 方法:取一张大小相当的感光胶片，在暗室内与滤纸重合在一起，并用一平板均匀压好，即开始“曝光”，时间长短由滤纸上放射性同位素强度决定，然后将胶片经显影、定影、冲洗即可。 ;七、Rf值确定;相同条件下，各种物质的Rf值分别是一个常数，与标准物质的Rf值比较可以定性地判断该分离组分是何种物质。 如果溶剂流出滤纸，溶剂前沿无法确定，可以一标准物的位置作参照，按下式计算Rf值： ;影响Rf值的主要因素 1、样品本身的性质与结构 物质极性的大小决定了物质在水和有机相之间的分配情况，例如酸性或碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，因此Rf值较低； 物质的极性取决于它所具有的极性基团的性质和数量； 常见的极性基团有羧基、氨基、羟基与酮基等。 ;在同系物中，疏水性的亚甲基基团增加，物质极性会降低。 ;;;2、溶剂的性质 溶剂系统的组成一与性质的改变直接影响分配系数，自然也会影响Rf值。 溶剂系统极性增加，物质的Rf值变大。 溶剂系统的极性取决于有机溶剂分子本身的极性及溶剂系统所含的其他极性物质的量，特别是含水量。 ;3、pH值 pH对Rf值的影响主要由pH与分配系数的关系决定。 由于溶剂的pH值改变，溶质的解离度增大，极性增强。 就氨基酸而言，pH值的改变对酸性及碱性氨基酸的Rf影响较大，对中性氨基酸的Rf影响较小。 ;4、展层温度 由于水在有机相中的溶解度随着温度的改变而变化，囚 此温度改变可以影响Rf值。 对温度敏感的溶剂体??，在层析分离时必须严格控制温度。 5、滤纸的性质 滤纸厚薄一致不匀，溶剂沿纤维方向的流动就会紊乱，溶剂扩展不一致，造成溶剂前沿不整齐，分离点畸形。 滤纸中金属离子含量较高时容易与被分离物形成配合物，使层析点出现阴影。 ;八、定量方法;思考题