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GFP融合蛋白的构建 应用亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，最终得到融合蛋白，可以研究目的蛋白在细胞或组织内的定位。 目的基因 gfp 基因 融合基因 转化 表达 检测 GFP融合蛋白的构建 最关键的就是：要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能。具体蛋白要具体分析。 将目的基因与gfp基因融合有以下几种方式: 将gfp置于目的基因后面，即目的基因-gfp 将gfp置于目的基因前面，即gfp-目的基因。 GFP融合蛋白的构建过程 利用PCR扩增靶基因，引物包含翻译起点和终止位点以及合适的限制性内切酶位点； 扩增的外源基因片段与载体连接； DNA测序确定外源基因序列未发生突变后，从载体上设计的酶切位点切下外源基因； 将外源基因亚克隆到pEGFP-N1和pDsRed1-N1-B载体中，即完成荧光定位表达载体的构建。 通过脂质体介导或其它转染方法，将质粒“单独”和“共同”转染真核细胞； 24～28h后，在常规的透射荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。 扩增p16ORF序列 目的片段和质粒双酶切 重组质粒菌液PCR鉴定 重组质粒双酶切鉴定 重组过表达质粒测序 p16过表达载体转染293细胞 GFP融合蛋白的构建 注意事项： 两个基因之间用Linker连接。 在两个基因交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数) ，如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三核苷酸。目的是使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较小，有利于GFP发光。 前一基因必须要有起始密码，而不能带有终止密码； 后一基因要保证有终止密码。 构建了融合基因后，必须测序进行验证，确保融合基因读框正确之后才能进行后续研究，以免浪费人力、 物力和宝贵的时间。 GFP融合蛋白的检测 定性检测：可以用常规的荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察； 定量检测：免疫印迹法 酶联免疫吸附法 可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固定细胞中的GFP。 GFP融合蛋白的检测 注意事项： 以GFP作为报告基因研究蛋白亚细胞定位，必须做对照。由于某些细胞本身也有自发荧光，必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以免假象干扰实验，避免得出错误结论。 并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表达，因此要尽可能多的获得转基因细胞，如果数目较少，可能会检测不到荧光。 荧光融合蛋白方法的优缺点 操作上比较容易掌握，步骤简便并易于检测。 荧光稳定、无毒害并且易于构建融合蛋白载体也容易获得突变体，因此进行活细胞定时定位的观察。 由于绝大多数细胞内没有内源性GFP和RFP表达，因此靶蛋白与GFP和RFP的融合蛋白必须经过转染，在细胞内过表达后，才能观察。 （一）荧光的基本知识 二、免疫荧光技术 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光（fluorescence） 。 荧光（fluorescence） 发射光谱和激发光谱 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 （一）荧光的基本知识 酵母单杂交系统应用 ①确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。 ②分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。 ③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 研究DNA-蛋白质相互作用 该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。 在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选。 在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。 利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。 反向酵母双杂交系统原理 反向双杂交系统基本原理示意图 这一系统利用了两个互相接合的报道基因，第一个报道基因含有大肠杆菌tetR抑制因子的编码序列，其表达受上游操纵子调控；第二个报道基因是His3，启动子区含有tet操纵子序列。分别与BD和AD融合的两个蛋白质在酵母细胞核内如果发生相互作用，将激活tetR的表达，tetR和tet操纵子序列的结合进一步影响His3基因的表达, 只有不能发生相互作用的蛋白质才能用这个系统在组氨酸缺陷的培养基上筛选出来。 反向双杂交系统基本原理示意图 双杂交产生的相互作用激活Te