临床微生物SOP-血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程.docVIP

1．目的 规范血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2．适用范围 血液及骨髓。 3．标本 3.1 标本类型 血液及骨髓。 3.2 标本采集 3.2.1 采血时间 抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。 3.2.2 采血频率 对怀疑菌血症的成年病人，推荐同时在不同部位采集2~3套（每套包括一瓶需氧瓶、一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶），对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；婴幼儿病人，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。3.2.3 采血量 以培养基的1/10为宜，成人一次采血5~10ml，婴幼儿1~2ml。 3.2.4 骨髓标本 用骨髓穿刺针从髂骨采集。 3.3 标本拒收标准 3.3.1 血培养瓶破裂或有明显污染。 3.3.2 培养瓶标识与化验申请单不符。 3.3.3 用过期的培养瓶采集标本、采血量不足等。 3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。 3.4 标本保存 采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放冰箱。冬季血培养瓶在送检过程中应采取一定的保温措施。 4．试剂、仪器 4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%过氧化氢、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板、相关生化试剂等。 4.2 BACT/Alert 3D或BACTEC 9000全自动血培养系统、VITEK鉴定系统。成人需氧培养瓶、厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶、革兰阴性菌鉴定卡(GNI+)、革兰阴性菌药敏卡(GNS)、革兰阳性菌鉴定卡(GPI)、革兰阳性菌药敏卡(GPS)、真菌鉴定卡(YBC)、药敏纸片、ATB板条等。 4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、C02培养箱等。 4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。 5．细菌鉴定和药敏质控 参见《质量管理程序》。 6．检验步骤 接收标本，立即对标本进行标号。门诊病人要同时登记住址，联系电话等病人信息。 6.1 自动化培养 将血培养瓶置全自动血培养仪中。当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射器抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医师报告，同时转种血琼脂平板、麦康凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5%CO2培养箱培养18～24小时。从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用GPI及GNI上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K-B法药敏试验。 6.2 手工培养 6.2.1 将血培养瓶35℃孵育箱，经18～20小时孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种一次。 6.2.2 盲目转种后，培养瓶继续孵育至第5日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片作革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂平板、麦康凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5%CO2培养箱培养18～24小时。次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。 6.3 特殊培养 6.3.1 布鲁菌属 通常将血液接种到双相血培养瓶内，培养环境应5%～10%CO2 35℃，每48小时观察有无细菌生长，若无细菌生长应继续培养，阴性应培养至30日后才可发出报告。 6.3.2 乏养菌 该细菌生长需要巯醇复合物和维生素B6。在血培养基中需加盐酸-磷酸吡多醛(0.001%)或L-半胱氨酸(0.05%～0.1%)或两者皆有，否则乏养菌不能生长。血培养物转种血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄球菌，靠近金黄色葡萄球菌有乏养菌生长。 6.3.3 L型细菌 在培养基中含有10%蔗糖或甘露醇时，才适合L型细落生长。 6.3.4心内膜炎特殊致病菌 如果常规血培养72小时阴性而病人临床症状仍提示感染性心内膜炎，应提高培养基的营养或补加添加剂。有利于分离营养要求苛刻、生长缓慢的革兰阴性杆菌，如人心杆菌、侵蚀艾肯菌、金氏菌、伴放线杆菌、军团菌等细菌，应延长培养至2～4周，然后转种特殊的培养基。 7. 操作流程 8. 结果报告 8.1 阳性结果报告 报告通常分为三级。 8.1.1 一级报告 阳性报警血培养瓶应进行涂片革兰染色，将涂片结果电话（或其他方式）通知临床，同时记录报告的日期、时间、内容以及接收报告人的姓名。血培养阳性应列为危急值。 8.1.2 二级报告 报告直接药敏试验结果。 直接药敏试验，将血培养阳性标本进行革兰染色，如涂片找到细菌，根据革兰染色结果选择药敏所用培养基（Muller - Hinton培养基或含5%羊血Muller - Hinton琼脂平板），取阳性肉汤标本约0.2 ml，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面，根据革兰染色结果选择所用抗菌药物的纸片，如镜检见革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科常用的抗菌药物纸片；若为革兰阳性球菌，成对排列，选择葡萄球菌用的抗菌药物纸片。然后置35℃，孵育6～7小