水稻的蛋白质、核酸提取分析综合大实验.docVIP

水稻的蛋白质、核酸提取分析 ? 前言：水稻是全世界最重要的粮食作物之一，其栽培面积和总产量仅次于小麦。我国是稻谷生产的大国。近年来水稻播种面积为世界第二，产量稳居第一。由于亚洲30多亿人口中4/5及非洲和拉丁美洲近30亿人口中1/3均以稻米为主要食物来源，所以水稻生产对发展中国家的重要性尤为突出。我国目前还是一个农业大国，搞好水稻的种植和研究对于国计民生具有重大意义。 一、实验目的： 1、掌握水稻的催芽技术； 2、掌握水稻的蛋白质、核酸提取分析技术； 3、加深对生物大分子提取分离技术、分光光度技术、凝胶电泳技术、高速离心分离技术的理解和运用。 4、掌握PCR、蛋白质印迹、SDS等分子生物实验技术。 ? 二、实验材料：水稻 ? 三、综合大实验模块及流程图： ? ? ? ? ? ? ??? 四、实验时间安排计划： （一）第一周 周一：查阅资料，药品准备、水稻的选种、浸种； 周二：查阅资料，药品准备、稻种消毒；稻种破胸、培养；记录； 周三: 实验讲解、药品准备，水稻过氧化物同工酶的电泳 周四: 水稻过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析; 周五: 水稻种子蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 （二）第二周 周一：水稻DNA提取及聚合酶链式反应扩增PsbA-trnH片段； 周二：Western-blot 检测人类TES蛋白在大肠杆菌中的诱导表达； 周三：数据整理、结果分析、讨论，书写实习报告。 ? 1. 水稻的催芽培养 一、 实验目的： 掌握水稻种子的浸种、消毒和催芽技术，以及实验室条件下水稻幼苗的培养方法。 ? 二、 实验原理： 水稻种子萌发需要的基本条件是种子活力、水分、温度和空气，对于处在非休眠期的种子来说，满足以上条件，就可以萌发生长。 水稻种子常带有稻粒黑粉病、恶苗病、胡麻斑病、绵腐病和稻瘟病等病菌。因此，进行稻种消毒处理，是防止病菌侵入，减轻水稻病害发生的重要措施。三氯异氰尿酸是一种高效、广谱、低毒、安全的消毒剂。为白色结晶性粉末，含有效氯80～85%，具有氯臭味，在水中分解成异氰尿酸和次氯酸，次氯酸扩散到细菌表面，并穿透细胞膜直接氧化菌体蛋白，从而消灭病原微生物，是一种极强的氧化剂，对细菌、病毒、真菌、芽孢有较强的杀灭作用。 ? 三、器材与试剂： 1、器材：恒温水箱、培养皿、恒温光照培养箱、500ml烧杯、玻棒、消毒脱脂棉 2、试剂：85％强氯精（三氯异氰尿酸）300－500倍液 ? 四、 实验材料：水稻种子 ? 五、 实验步骤 （一）种子的浸种消毒： 　　1．强氯精浸种：稻种先用清水浮选、预浸（早稻常规24小时，杂交稻12小时）吸水，再用85％强氯精300－500倍液浸24小时，浸后清水3～5次洗净再催芽。 　　2．多菌灵浸种：50％超微多菌灵可湿性粉剂500倍液浸种（即100克多菌灵兑水50公斤，可浸种子35－40公斤）48小时，浸后洗净再催芽。 3. 使百克浸种：用25％使百克乳油2500－3000倍液浸48小时，浸后可直接进行催芽播种。 （二）种子的破胸催芽： 将消毒清洗后的稻种沥去明水，在40℃的干净热水中加热15～30分钟，也可用烧杯装种子和清水的混合物（1：1）进行水浴，期间搅拌数次，促进水稻种皮的发胀破裂。在培养皿内铺1厘米厚的消毒棉花，将加热后的稻种捞出，均匀摊在棉花表面，加入与棉花等高的清水，放入温度28℃、湿度80%的培养箱里光照培养。每天观察一次，并及时浇水。 ? 六、注意事项 1.清水浮选和消毒时要剔除秕谷和病谷，以免以后长菌； 2.培养时浇水要适量，过多易导致根部发霉。 ? ? 2. 1 植物组织中过氧化物酶同工酶的电泳分析 　　──聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳 ?? 一．??目的要求 同工酶是一组催化相同化学反应，而结构、理化性质及在组织中的分布均不同的酶。由于同工酶广泛分布于各种生物体内，并且在表达上具有组织特异性、器官特异性和生长发育时期的特异性，所以，通过分析同工酶，可以从分子水平研究植物的生长发育规律和遗传变异规律。本实验要求掌握过氧化物酶同工酶的电泳分析原理及柱状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。 ? 二．????实验原理 　　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺（简称TEMED）的催化下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。通过改变凝胶的浓度和交联度，来控制凝胶孔径的大小；通过改变催化剂的用量，控制凝胶聚合的速度。本实验采用不连续的电泳体系，使样品在不连续的两相之间积聚浓缩成很薄的起始区带（约10－2cm），然后再根据电荷效应和分子筛效应进行分离。电泳区带用特异性染色法显示出过氧