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第四章 高 效 液 相 色 谱 法 （HPLC） high performance Liquid chromatography 一. 高效液相色谱法的特点： 1、高压 2、高效 3、高速 4、高灵敏度 5、应用广泛 HPLC 与 GC 共同点： 1、色谱的基本理论是一致的 2、定性定量原理完全一样 HPLC 与 GC 区别： 1、流动相不同 2、固定相不一样 3、仪器的结构差别较大 二. 高效液相色谱仪的结构 1. 高压输液系统 P.244 (1) 贮液罐 用于存放流动相，其位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差，应耐腐蚀，尽可能密闭，以防因溶剂易挥发而引起流动相组分的变化以及空气中的O2、CO2等重新溶于已脱气的流动相中。 (2)、高压输液泵 P.245 其产生高压将流动相送入系统，所以对高压泵有如下要求： a. 泵体材料能耐化学腐蚀； b. 能在高压连续工作； c. 输出流量范围宽； d. 输出流量稳定，重复性高 (3) 梯度淋洗装置 P.245 2. 进样系统 P. 246 它将待分析的样品注入系统进行分析。目前主要采用六通阀为核心的额进样器，其有“进样”和“取样”两个位置，当处于“取样”位置时，流动相不经过样品管，此时可打开进样口注入样品到样 品管，封上进样口，然后切换到进样的位置，流动相就经过样品管冲洗样品到色谱柱完成进样的动作。如果是自动进样器，则这一切将按程序自动完成取样、进样、复位、样品管路清洗等过程。 3. 分离系统（色谱柱） P.246 色谱仪中的分离核心，样品在此完成分离，故其性能对分析结果起关键作用，其主要参数有填料的类型、柱子长度、内径的大小等。 4. 检测系统 P.247 主要用于监测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，并由数据处理系统绘出图谱来进行定性和定量分析。理想的液相色谱监测器应具备如下特征： ⑴灵敏度高； ⑵对所有的溶质都有响应； ⑶响应对流动相流量和温度的变化都不敏感； ⑷不引起柱外谱带扩展； ⑸线性范围宽； ⑹适用范围广。 常用的检测器有紫外检测器（UVD）、示差折光检测器（RID）、电导检测器（ECD）、荧光检测器（FD）和蒸发激光散射检测器（ELSD等。 5. 数据处理系统 色谱分析结果,以前主要采用记录仪和积分仪来处理.现在几乎都使用PC机结合色谱工作站来处理数据，大大提高了工作效率和结果的准确性。 HPLC分析常用的几种色谱分离模式的原理和应用 P.250 1.固定相 流动相 2.高效液相色谱通常依据溶质（样品）在固定相和流动相分离过程的物理化学原理来分类，主要有以下几种色谱分离模式： 1)、吸附色谱 2)、分配色谱 3)、离子色谱 4)、体积排阻色谱 （凝胶色谱 ） 5)、亲合色谱法 6)、手性色谱法 2). 分配色谱 (1)正相色谱：流动相极性小，固定相极性大 (2)反相色谱：流动相极性大，固定相极性小 各种色谱法的比较 方法 项目 吸附色谱 分配色谱 离子色谱 排阻色谱 亲合色谱 固定相 全多孔固体吸附剂 键合在基体上的键合相基团 高效微粒离子交换剂 具有不同孔径的多孔凝胶 键联在基体上的特异配位体 流动相 不同极性有机溶剂 不同极性有机溶剂和水 不同PH的缓冲溶液 有机溶剂或一定PH缓冲液 可加改性剂的PH缓冲液 分离原理 吸附(解吸 溶解(挥发 可逆性离子交换 多孔性凝胶的渗透或过滤 钥匙结构络合物可逆性离解 平衡常数 吸附系数KA 分配系数KP 选择性系数KS 分布系数KD 稳定常数KC 主要应用 中等分子量的脂溶性化合物 大多数的化合物的分离与分析 离子型化合物的分离与分析 大分子的化合物的分离和分子量测定 生物活性物质的分离与分析 四. 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 准备工作 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成? 1.选择一种适当的色谱分离模式，见下图。 2.选择一根合适的色谱柱，包括规格和