两种实时定量聚合酶链反应方法检测血浆微量微RNA的比较-华西医学.PDF

华西医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 • 1 •   ·论 著· 两种实时定量聚合酶链反应方法检测血浆 微量微 RNA 的比较 陈雪梅，丁雨，吴思思 四川大学华西医院公共实验技术中心（成都  610041 ） 【摘要】   目的    微 RNA （microRNA ，miRNA ）作为新一代肿瘤诊断和分子靶向治疗的标志物，其定量研究 是关键，比较用茎环和多腺苷酸聚合酶（poly A polymerase ，PAP ）加尾实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR ）法检测血浆中微量 miRNA 的区别，并评价 2 种常用内参基因的表达稳定性。方法    分离成年 Sprague Dawley 大鼠血浆提取 miRNA ，使用茎环和 PAP 加尾实时定量 PCR 法检测血浆中 rno-miR-200b-3p 和 rno-miR-126-3p 的表达水平，采用 rno-miR-103a-3p 和 U6 作为内参，最后采用 2 △Ct 法计算比较两种实时定量方法 和内参的选择。结果    茎环法相较于 PAP 加尾法检测 Ct 值可以降低 2 ～4 个循环数、检测灵敏度增加了 10 倍； 加尾法溶解曲线在明显单峰之前可见小峰，茎环法显示独立单峰，茎环法特异性更优；U6 作为内参相对于 miR- 103a 更稳定。结论    对于 miRNA 浓度偏低的少量样本检测，茎环法有准确、灵敏、特异的优点；对于 miRNA 含 量丰富、大规模组织样本的检测，加尾法则更适用。对于内参基因的选择，本实验使用 U6 进行 miRNA 半定量相 对于 miR-103a-3p 更稳定，重复性更强。 【关键词】  微 RNA ；茎环法；多腺苷酸聚合酶法；实时定量聚合酶链反应；血浆 Detection of plasmatic trace amounts of miRNAs with two kinds of small RNA real-time PCR method CHEN Xuemei, DING Yu, WU Sisi Core facility of West China Hospital, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041, P.R.China Corresponding author: WU Sisi, Email: 949189109@ 【Abstract 】 Objective    miRNAs as the new bio-markers of tumor diagnosis and molecular targeted therapy, its quantitative research is very important. We used stem-loop and PAP (Poly A Polymerase) real-time PCR quantitative method to detect traces of miRNAs in plasma, and assess the more stable reference’s gene. Methods    miRNAs were extracted from plasma of adult SD rats’plasma, and were detected the expression of rno-miR-200b-3p and rno-miR-126- 3p with stem-loop and PAP real-time PCR quantitative method, rno-miR-103a-3p and U6 as internal controls. All the results were evaluated by 2Ctmethod. Results    Comparison with PAP method, the stem-loop method reduced Ct value 2–4