猪胸腊肺炎放线杆菌APXⅡ抗原表位表达及间接ELISA方法建立与应用Epitope expression of Actinobacillus actinomycetes APX II antigen epitopes and the establishment and application of indirect ELISA method.pdf

万方数据 万方数据 摘要 猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌 （APP ）引起的一种以出血坏死性肺 炎和纤维素性胸膜炎为特征的呼吸道传染病，是危害现代养猪业最严重的疾病之一。 迄今，APP 共有 15 个血清型。Apx 毒素是APP 主要的毒力因子和免疫原，15 种血 清型共产生四种毒素：Apx Ⅰ、Apx Ⅱ、ApxⅢ、ApxⅣ。Apx 毒素分泌需要操纵子C、 A 、B 、D 4 种基因的共同作用，A 基因是毒素的结构基因。除了血清10 型，其余血 清型均产生Apx Ⅱ。以Apx Ⅱ蛋白为基础建立ELISA 方法可作为一种跨越血清型障 碍的检测方法，对除 10 型外所有血清型作出检测。本研究利用基因工程的方法表达 Apx ⅡA 蛋白的主要抗原表位区，并基于此建立检测猪血清中APP 抗体的间接ELISA 方法，为疾病诊断和疫苗免疫效果评估奠定了基础。主要研究内容如下： 1 猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ主要抗原表位区原核表达和优化 将猪胸膜肺炎放线杆菌 Apx Ⅱ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a (+) ，构建重组质粒 pET-Apx ⅡA1 。将重组质粒 pET-Apx ⅡA1 转化至宿主菌 BL21 （DE3 ）中，经IPTG 诱导后，外源基因获得高效表达。最佳诱导条件为加入终 浓度为 1mmol/mL 的 IPTG 37 ℃诱导5h，融合蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀 中。通过Western-blot 分析重组蛋白可被兔抗APP 阳性血清特异性识别，表明表达产 物具有良好的免疫原性。 2 基于Apx Ⅱ主要抗原表位区的间接ELISA 方法建立 将猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ主要抗原表位重组蛋白作为包被抗原，包被酶标 板，建立了检测猪APP 血清抗体的间接ELISA 方法。通过反应条件的优化，初步确 定了间接ELISA 方法的最佳反应条件：其抗原的包被浓度为1.23μg/mL；血清稀释度 为1：100；4 ℃包被过夜；1%BSA 37℃封闭1h；一抗反应时间为60min ；酶标二抗 工作浓度为1：10 000；最佳底物显色时间为4min 。确定了间接ELISA 方法的临界 值，对其特异性和重复性进行了检测，并与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对 94 份临床非免疫血清样品进行检测，两者的符合率为90.4%，表明所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性、重复性。 3 江苏安徽两省部分猪场猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查 用建立的间接ELISA 方法对江苏安徽两省部分猪场2013 年采集送检的未免疫猪 胸膜肺炎放线杆菌的血清共计552 份检测APP 抗体，检出230 份，总阳性率为41.67% 。 江苏送检的12 个猪场共460 份血清，血清总阳性率为40.65% ；安徽送检的5 个猪场 共92 份血清，血清总阳性率为46.74% 。其中种猪血清总计106 份，血清总阳性率为 64.15%；南通、徐州两地猪场共送检血清98 份，妊娠母猪、育肥猪、保育猪、哺乳 I 万方数据 猪的血清阳性率分别为100%、25% 、14.29%、84.21%。两省的大部分猪场均存在猪 胸膜肺炎放线杆菌感染情况，不同生长阶段的猪群均可感染APP 。 综上所述，本试验成功原核表达获得猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ主要抗原表位区 基因片段编码的蛋白，建立了检测猪血清APP 抗体的间接ELISA 方法，并对江苏安 徽两省部分猪场猪胸膜肺炎放线杆菌感染情况进行了调查。 关键词： 猪胸膜肺炎放线杆菌；Apx Ⅱ；原核表达；间接ELISA ；流行病学调查； II 万方数据 Abstract