微生物染色.doc

实验3　微生物的染色 3．1　实验目的 　　(1)了解微生物的染色原理。 　　(2)学习微生物涂片染色操作技术。 　　(3)掌握微生物单染色及革兰氏染色方法。 3．2　染色原理 　　一般微生物，特别是细菌无色透明，在光学显微镜下，菌体与背景的反差很小，难以分辨其形态与结构，染色后可增加其反差，以利于观察。 　　(1)单染(普通染色)　　单染是只用一种染料使菌体着色，便于观察菌体的形态。 　　菌体内含有大量的蛋白质，使微生物细胞具有两性电解质性质，在某一pH值时，菌体所带的正负电荷相等，该pH值即为细胞的等电点(pI)。通常细菌的等电点约为2～5。 　　当环境的pH值比菌体的等电点低时，菌体带正电荷，易与带负电荷的酸性染料结合。在细菌所要求的pH值(中性或略大于中性)条件下，细菌带有负电荷，故多以碱性染料染色。常用的碱性染料有结晶紫、龙胆紫、美蓝、碱性品红、孔雀绿、番红花红及中性红等。 　　(2)革兰氏染色(复染色法或鉴别染色法)　　革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴定方法。该方法是l884年由丹麦学者Christain Gram 创立的，此后人们在实践中又作了一些改进。通过这种方法可将细菌分为革兰氏染色阳性细菌(G+)和革兰氏染色阴性细菌(G-)两大类。其基本原理如下。 　　革兰氏染色结果是由细菌的细胞壁决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高且呈网状结构，细胞壁较厚，类脂质含量低；革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量低，细胞壁薄，类脂质含量高。前者用酒精脱色时，细胞壁因脱水肽聚糖层网孔变小，其通透性降低，使结晶紫-碘的复合物不易被抽取而继续留在细胞内，经脱色和复染后仍保留着初染剂结晶紫的颜色(紫色)；后者用酒精脱色时，类脂质被酒精溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫-碘的复合物易被抽取出来，紫色褪去，用复染剂复染后，细胞的颜色即呈复染剂的颜色(红色)。革兰氏染色最关键的步骤是酒精脱色。事实上，用结晶紫进行初染时所有的细菌都被染成紫色。碘是一种媒染剂，能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，以增强染料与细菌的结合力。只有经过酒精处理，再经复染，不同的细菌才会显现出不同的染色结果。 3．3　实验仪器、材料 　　(1)显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 　　(2)美蓝染液、结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红花红染液。 　　(3)大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、活性污泥等。 3．4　操作步骤 　　(1)单染 　　①涂片(图12)　在干净的载玻片中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧灼，冷却后，以无菌操作(图12)挑取少量菌种于载玻片水滴中，或用吸管直接滴一滴活性污泥悬液于载玻片上，混匀并涂成薄膜，注意涂布面积不要太大。 　　②干燥　自然干燥。 　　③固定　将已干燥的涂片正面朝上，于火焰顶上迅速通过2～3次，使其蛋白质凝固，以固定细菌外形，并使其不易脱落。但切忌直接在火上烧玻片，以防菌体变形。 　　④染色　在涂片薄膜上滴加染液(美蓝或结晶紫)1～2min。 　　⑤水洗　倾斜载玻片，打开水龙头，用细水流冲洗(最好沿载玻片对角线冲洗)，直至冲洗水无色为止。 图12　无菌操作和涂片方法 　　(a)烧接种环灭菌；(b)拔下棉塞；(c)轻烧试管口；(d)接种环伸进试管挑菌； (e)取出接种环，再烧一烧试管口；(f)塞好棉塞，(g)涂片；(h)烧灼接种环；⑥镜检　用吸水纸轻轻地将涂片边缘的水珠吸掉，晾干后于显微镜下观察，并绘图。 　　(2)革兰氏染色(图13) 　　①涂片　同单染。 图13　革兰氏染色过程 　　(a)加结晶紫染lmin；(b)水洗；(c)加碘液媒染lmin；(d)水洗；(e)酒精脱色；(f)水洗；(g)番红花红复染2min；(h)水洗；　　(i)用吸水纸吸干 　　②干燥　同单染。 　　③固定　同单染。 　　④初染　结晶紫染色lmin，水洗。 　　⑤媒染　用碘液媒染lmin，水洗。 　　⑥酒精脱色　倾斜载玻片，滴加乙醇至流下的乙醇不显紫色(或20～30s)，立即水洗。这是革兰氏染色最关键的一步，脱色过度，本来的阳性菌会被误认为是阴性菌；脱色欠度，阴性菌会被误认为是阳性菌，均造成错误结果。 　　⑦复染　番红花红复染2min，水洗。 　　⑧镜检　用吸水纸吸走水滴，晾干后，用显微镜观察。 3．5　实验报告 　　绘出菌体形态，并给出革兰氏染色结果。 思考题 　　1．简述微生物染色原理。　　2．革兰氏染色中若不用番红花红复染，能否区分G+菌和G-菌?请解释。